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各種常見種類PCR概述介紹
閱讀：1758 發(fā)布時間：2023-12-4PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，是一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR的常見種類分述如下：
1、普通PCR
普通PCR即一代PCR，使用普通PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增靶基因，并通過瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。
2、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
實時熒光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團(tuán)，在整個PCR過程中通過收集熒光信號實時監(jiān)測每一個循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對待測樣品進(jìn)行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針法。
①熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中zui 常用的熒光染料，它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應(yīng)體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會在過程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號。因此，反應(yīng)中發(fā)出的全部熒光信號就會與反應(yīng)中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強(qiáng)度也會隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合，因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。
優(yōu)點：價格相對較低；使用方便；對DNA模板沒有選擇，通用性好；檢測靈敏度高。
缺點：可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，需要通過熔解曲線分析識別擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴(kuò)增；不適合進(jìn)行多重qPCR檢測。
②熒光探針法（TaqMan技術(shù)）：TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測中zui常用的檢測方法。PCR擴(kuò)增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針是一個寡核苷酸，5'端標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)（Reporter, R），3'端標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)（Quencher, Q）。當(dāng)探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，以至于無法檢測到熒光信號；而當(dāng)PCR擴(kuò)增時（在延伸階段），探針會被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，報告基團(tuán)發(fā)射底的熒光不會再被吸收，從而可以在熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA，就形成一個熒光分子，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成wan全同步，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號累積的越多，熒光強(qiáng)度越大。
優(yōu)點：檢測特異性強(qiáng)；靈敏度高；適合進(jìn)行多重qPCR檢測；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時間和原料成本。
缺點：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以完，本底較高；檢測結(jié)果很難判斷實際的擴(kuò)增特性。
注：多重PCR，也稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在一個反應(yīng)體系中加入兩對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段
的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)。
3、數(shù)字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）
數(shù)字PCR即三代PCR，是對原始PCR的另一種改進(jìn)，是一種能夠?qū)崿F(xiàn)核酸絕對定量的精準(zhǔn)檢測技術(shù)，基于泊松分布原理將核酸樣品分配到大量獨立、平行的微反應(yīng)單元（納升級）中，使每個反應(yīng)室中平均只有一個拷貝或者沒有目標(biāo)DNA分子，然后加入熒光信號進(jìn)行擴(kuò)增，從而實現(xiàn)靶標(biāo)核酸分子的絕對計數(shù)，提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度。
4、逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscription-PCR,RT-PCR）
逆轉(zhuǎn)錄PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR，將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合，是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進(jìn)行，一步法是RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一試管中進(jìn)行；而在兩步法中兩個反應(yīng)是分開依次進(jìn)行的。
5、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR,RT-qPCR）
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合，其中的“RT"是Reverse transcription（逆轉(zhuǎn)錄）的意思，所以RT-qPCR就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR進(jìn)行定量檢測分析。因為RT-PCR只可以定性，但不能進(jìn)行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴(kuò)增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進(jìn)行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進(jìn)行。