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技術(shù)文章

各種常見種類PCR概述介紹

閱讀:1819          發(fā)布時間:2023-12-4

    PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱,是一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR的常見種類分述如下:

1、普通PCR

普通PCR即一代PCR,使用普通PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增靶基因,并通過瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。


2、實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)

實(shí)時熒光定量PCR,也叫Real-Time PCR,即二代PCR,是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團(tuán),在整個PCR過程中通過收集熒光信號實(shí)時監(jiān)測每一個循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對待測樣品進(jìn)行定量分析。qPCR常用的有兩種方法:SYBR Green法和TaqMan探針法。

①熒光染料法(SYBR Green):SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中zui 常用的熒光染料,它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應(yīng)體系中,加入SYBR Green Ⅰ,它就會在過程中與雙鏈DNA結(jié)合,從而產(chǎn)生熒光信號。因此,反應(yīng)中發(fā)出的全部熒光信號就會與反應(yīng)中雙鏈DNA的量呈正比,熒光強(qiáng)度也會隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合,因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

優(yōu)點(diǎn):價(jià)格相對較低;使用方便;對DNA模板沒有選擇,通用性好;檢測靈敏度高。

缺點(diǎn):可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果,需要通過熔解曲線分析識別擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性;需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴(kuò)增;不適合進(jìn)行多重qPCR檢測。

②熒光探針法(TaqMan技術(shù)):TaqMan探針是最早用于定量的方法,也是臨床檢測中zui常用的檢測方法。PCR擴(kuò)增時,加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針是一個寡核苷酸,5'端標(biāo)記一個熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R),3'端標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)。當(dāng)探針完整時,報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,以至于無法檢測到熒光信號;而當(dāng)PCR擴(kuò)增時(在延伸階段),探針會被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解,使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,報(bào)告基團(tuán)發(fā)射底的熒光不會再被吸收,從而可以在熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA,就形成一個熒光分子,PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成wan全同步,PCR產(chǎn)物越多,熒光信號累積的越多,熒光強(qiáng)度越大。

優(yōu)點(diǎn):檢測特異性強(qiáng);靈敏度高;適合進(jìn)行多重qPCR檢測;PCR后續(xù)無需處理,節(jié)省時間和原料成本。

缺點(diǎn):需要根據(jù)不同的序列,合成不同的探針;探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性,定量時容易受試劑和酶性能影響;淬滅難以完,本底較高;檢測結(jié)果很難判斷實(shí)際的擴(kuò)增特性。                         

注:多重PCR,也稱多重引物PCR或復(fù)合PCR,是在一個反應(yīng)體系中加入兩對以上引物,同時擴(kuò)增出多個核酸片段

的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)。


3、數(shù)字PCR(Digital PCR, Dig-PCR, dPCR)

數(shù)字PCR即三代PCR,是對原始PCR的另一種改進(jìn),是一種能夠?qū)崿F(xiàn)核酸絕對定量的精準(zhǔn)檢測技術(shù),基于泊松分布原理將核酸樣品分配到大量獨(dú)立、平行的微反應(yīng)單元(納升級)中,使每個反應(yīng)室中平均只有一個拷貝或者沒有目標(biāo)DNA分子,然后加入熒光信號進(jìn)行擴(kuò)增,從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)核酸分子的絕對計(jì)數(shù),提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度。


4、逆轉(zhuǎn)錄PCR(ReverseTranscription-PCR,RT-PCR)

逆轉(zhuǎn)錄PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR,將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合,是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛,可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平,細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進(jìn)行,一步法是RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一試管中進(jìn)行;而在兩步法中兩個反應(yīng)是分開依次進(jìn)行的。


5、實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Real-time RT-PCR,RT-qPCR)

Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合,其中的“RT"是Reverse transcription(逆轉(zhuǎn)錄)的意思,所以RT-qPCR就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄PCR,即以mRNA或總RNA為模板,先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,再以cDNA為模板,通過熒光定量PCR進(jìn)行定量檢測分析。因?yàn)镽T-PCR只可以定性,但不能進(jìn)行定量分析。與RT-PCR一樣,RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法:一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后再將其作為qPCR擴(kuò)增的模板,只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進(jìn)行,兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進(jìn)行。


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