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技術(shù)文章

PCR基因擴(kuò)增儀應(yīng)用詳細(xì)說明

閱讀:244          發(fā)布時間:2024-12-3

一、原理

  PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增,加熱使雙鏈DNA解開螺旋,在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交,在Taq DNA聚合酶,dNTPs,Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物,重復(fù) “變性→退火→引物延伸"過程至25~40個循環(huán),呈指數(shù)級擴(kuò)大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。

二、分類

1. 普通的PCR儀

  一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個特定退火溫度的PCR儀,又叫傳統(tǒng)的PCR儀。

  用途:主要是做一些簡單的、對單一退火溫度的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。

 ?。?)梯度PCR儀: 一次PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度),通常為12種溫度梯度的普通PCR儀。

  用途:研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增。

 ?。?)原位PCR:將具有細(xì)胞定位能力的原位雜交技術(shù)運(yùn)用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析,在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增的普通PCR儀。

  用途:用于在細(xì)胞的靶DNA所在位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增。

2. 實(shí)時熒光定量PCR儀

  PCR擴(kuò)增時加入的引物利用熒光素進(jìn)行標(biāo)記,使引物和熒光探針同時與模板進(jìn)行特異性結(jié)合,擴(kuò)增結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實(shí)時采集信號并輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng),實(shí)時輸出量化結(jié)果,這樣的PCR儀叫實(shí)時熒光定量PCR儀。

 ?。?)金屬板式實(shí)時定量PCR儀

  可作為普通PCR儀使用

  可帶梯度功能

  可容納的樣本量大,無需特殊耗材

  溫度均一性欠佳,有邊緣效應(yīng),標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品全一致

 ?。?)離心式實(shí)時定量PCR儀

  溫度均一性較好

  使用的是同一個激發(fā)光源和檢測器,隨時檢測旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品,有效減少系統(tǒng)誤差

  可容納樣品量少,有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管,增加了使用成本,也不帶梯度功能

 ?。?)各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀

  不同樣品槽分別擁有獨(dú)立的智能升降溫模塊,各孔獨(dú)立控溫,適合多指標(biāo)快速檢測。

  SmartCyclerⅡ的軟件允許一臺儀器同時操作六個樣品模塊,既滿足高速批量要求,又能靈活運(yùn)用,還可實(shí)現(xiàn)任意梯度反應(yīng)。

  SmartCyclerⅡ上樣不如傳統(tǒng)方法方便,而且需要有的扁平反應(yīng)管,使用成本較高。

三、操作規(guī)程

  普通PCR擴(kuò)增儀的操作非常簡便,接通電源,儀器自檢,設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲存的程序運(yùn)行即可。

  定量PCR擴(kuò)增儀的操作和普通PCR儀基本相同。

四、常見故障

 ?、贌晒馊玖衔廴緲悠房?;

 ?、赑CR管融化,原因可能是溫度傳感器出問題或是熱蓋出問題;

 ?、蹅€別孔擴(kuò)增效率差異很大,可能的原因是半導(dǎo)體模塊出現(xiàn)壞點(diǎn);

 ?、軣晒鈴?qiáng)度減弱或不穩(wěn)定,產(chǎn)生的原因有濾光片發(fā)霉或有水汽,或光源損耗(以鹵鎢燈為光源的),需更換光源;或需調(diào)節(jié)檢測元件靈敏度;

  ⑤儀器工作時出現(xiàn)噪音。

  以上故障部分可自行檢查,部分需工程師檢修。



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