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活性氧 (ROS) 含量檢測試劑盒實驗詳細說明
閱讀：426 發(fā)布時間：2024-12-9活性氧含量檢測試劑盒通過使用特異性探針或底物與ROS發(fā)生化學反應，從而實現對ROS含量的測定。這種檢測方法基于探針或底物與ROS的特異性反應，通常使用熒光分光光度計或流式細胞術進行測量。
活性氧含量檢測試劑盒具有以下幾個優(yōu)勢：
1. 高選擇性：活性氧含量檢測試劑盒能夠特異性地檢測ROS，避免了其他化學物質的干擾，確保測量結果的準確性。
2. 高靈敏度：活性氧含量檢測試劑盒能夠檢測到極低濃度的ROS，使研究人員能夠對ROS含量進行準確測量，揭示微小變化對細胞功能和疾病發(fā)展的影響。
3. 快速和簡便：活性氧含量檢測試劑盒提供了一種快速、簡便的方法來測量ROS含量，節(jié)省了實驗室人員的時間和精力。
4. 可靠性和重復性：活性氧含量檢測試劑盒具有良好的可靠性和重復性，可以在不同實驗條件下進行重復測量，確保結果的準確性和可重復性。
活性氧 (ROS) 含量檢測試劑盒應用領域：
活性氧含量檢測試劑盒在生物醫(yī)學研究中具有廣泛的應用。以下是一些應用領域的例子：
1. 氧化應激研究：通過測量ROS含量，研究人員可以評估細胞氧化應激的程度，揭示ROS與疾病發(fā)生和發(fā)展的關聯，如癌癥、心血管疾病和神經退行性疾病等。
2. 藥物篩選：活性氧含量檢測試劑盒可用于藥物篩選，評估候選藥物對ROS產生和清除的影響，從而尋找潛在的抗氧化劑或氧化劑。
3. 環(huán)境毒性評估：活性氧含量檢測試劑盒可用于評估環(huán)境污染物對細胞ROS產生的影響，揭示環(huán)境毒性與氧化應激的關系。
實驗步驟如下：：
對于刺激時間較短的細胞（通常少于2小時），建議先加載探針，然后用活性氧自由基陽性對照物或感興趣的藥物刺激細胞；對于需要長時間刺激的細胞（通常超過6小時），建議在加載探針之前用活性氧自由基陽性對照物或感興趣的藥物刺激細胞，這里只提供后一種實驗方法。
1. 原位加載探針（僅適用于附著細胞）
a) 細胞準備：在測試前一天放置細胞板，確保細胞數目小于5×10^5/mL。
b) 藥物誘導：去除細胞培養(yǎng)基，加入無血清稀釋藥物處理細胞，在黑暗中在37°C細胞培養(yǎng)箱中孵育。實際誘導時間取決于藥物特性和細胞類型。
c) （可選）陽性對照：用無血清培養(yǎng)基稀釋陽性對照物H2O2，從100 mM稀釋到正常工作濃度的100 μM。細胞在黑暗中孵育37°C，時間為30分鐘至4小時。為了提高活性氧自由基的水平，不同細胞類型的實際時間不同。例如，HeLa細胞需要處理30-60分鐘。注意：陽性對照僅在陽性對照孔中需要，其他實驗組不需要。
d) 活性氧自由基探針的制備：用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，最終濃度為10 μM。
e) 加載活性氧自由基探針：去除處理藥物，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞1-2次，加入適量稀釋的DCFH-DA工作溶液，細胞需要全覆蓋，例如6孔板通常添加不少于1 mL/孔，96孔板通常添加不少于100 μL/孔。細胞在37°C培養(yǎng)箱中黑暗中孵育30分鐘。
f) 清洗細胞：細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌1-2次，去除未進入細胞的DCFH-DA。
2. 收集細胞并加載探針（適用于附著細胞和懸浮細胞）
a) 細胞準備：按照標準方法培養(yǎng)細胞。需要確保用于測試的細胞狀態(tài)良好。根據適當的方法清潔并收集足夠數量的細胞。
b) 藥物誘導：收集的細胞懸浮在適量的稀釋藥物中，在37°C培養(yǎng)箱中黑暗中孵育。實際誘導時間可以根據藥物特性和細胞類型確定。
c) （可選）陽性對照：用無血清培養(yǎng)基稀釋陽性對照物H2O2，從100 mM稀釋到正常工作濃度的100 μM。細胞在黑暗中孵育37°C，時間為30分鐘至4小時。為了提高活性氧自由基的水平，不同細胞類型的實際時間不同。例如，HeLa細胞需要處理30-60分鐘。
d) 活性氧自由基探針的制備：用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，最終濃度為10 μM。
e) 探針加載：離心收集細胞，去除處理藥物，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞1-2次，再次離心收集細胞，加入稀釋的探針，使細胞密度為1.0×10^6-2.0×10^7。細胞在37°C培養(yǎng)箱中黑暗中孵育30分鐘。注意：細胞密度應根據后續(xù)的檢測系統、檢測方法和總檢測量進行調整。例如，對于流式細胞術，單管中的細胞數目不應少于10^4且不超過10^6。
f) 清洗細胞：用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞1-2次，去除未進入細胞的DCFH-DA。
3.熒光顯微鏡照片
a) 附著細胞（步驟1.f）可以直接在熒光顯微鏡下觀察；對于懸浮細胞（步驟2.f），將25-50 μL細胞懸浮液滴在顯微鏡載玻片上，用蓋玻片覆蓋進行觀察。
b) 在熒光顯微鏡下，使用FITC濾光片觀察熒光，并去除背景以觀察熒光變化。
4. 流式細胞術的操作和分析方法
a) 附著細胞（步驟1.f）用胰蛋白酶消化制備單細胞懸浮液；對于懸浮細胞（步驟2.f），直接收集細胞。細胞用0.5-1 mL PBS（0.5-1×10^5/mL）重新懸浮。
b) 在流式細胞術中，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm?？梢詫崟r或定時檢測刺激前后熒光強度的變化。