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技術(shù)文章

植物根系活力檢測試劑盒(TTC法)實(shí)驗(yàn)操作步驟

閱讀:49          發(fā)布時(shí)間:2025-4-1

    植物根系是活躍的吸收器官和合成器官,根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。本實(shí)驗(yàn)練習(xí)測定根系活力的方法,為植物營養(yǎng)研究提供依據(jù)。

氯化三苯基四氮唑(TTC)是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素,溶于水中成為無色溶液,但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲瓚,生成的三苯甲瓚比較穩(wěn)定,不會被空氣中的氧自動氧化,所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體,植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。

操作步驟:

建議正式實(shí)驗(yàn)前選取2個(gè)樣本做預(yù)測定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)!

1、預(yù)實(shí)驗(yàn)樣本制備

將根部組織洗凈,去除根上的泥土,輕輕擦干,不要過分?jǐn)D壓破壞根系細(xì)胞。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

① 臨用前取 10μL 10mg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)液,加入1990μL試劑二,充分混勻,配制成 50μg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。(后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要1000μL,為減小實(shí)驗(yàn)誤差,故配制大體積。)

② 取 1mL 50 μg/mL TTC 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到一支試劑三內(nèi),充分震蕩混勻2min。混勻后加入 1mL 乙酸乙酯,再次充分震蕩混勻2min,室溫靜置分層5min,取上層溶液。

③ 將上層溶液用乙酸乙酯進(jìn)行稀釋,得到20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用(吸取200μL 50μg/mL TTC加入300μL乙酸乙酯混勻即可)。

3、預(yù)實(shí)驗(yàn)上機(jī)操作:

① 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至485nm。

② 標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定:取 200μL 20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和200μL乙酸乙酯(即0μg/mL)于96孔板(非聚苯乙烯材質(zhì))中,分別測定其在485nm處的吸光度,分別記為A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管。計(jì)算ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。ΔA標(biāo)準(zhǔn)只需做1-2次。

③ 操作表:

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4、正式實(shí)驗(yàn):

① 若樣品 37℃暗反應(yīng)未到4h但根系已出現(xiàn)深粉色,此時(shí)可以直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作;若ΔA測定大于1.5,可以減少樣本質(zhì)量或者縮短反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn),計(jì)算公式注意修改;

② 若4h暗反應(yīng)結(jié)束后,根系沒有出現(xiàn)粉色或者ΔA測定小于0.005,可以延長暗反應(yīng)時(shí)間(8h,16h甚至24h)或者加大樣品量,計(jì)算公式注意修改。

③ 確定好最適實(shí)驗(yàn)條件后,正式實(shí)驗(yàn)樣本制備同預(yù)實(shí)驗(yàn)樣本制備;

④ 正式實(shí)驗(yàn)按照預(yù)實(shí)驗(yàn)上機(jī)操作步驟進(jìn)行(標(biāo)準(zhǔn)管和空白管預(yù)實(shí)驗(yàn)已做,正式實(shí)驗(yàn)可選做)。

五、結(jié)果計(jì)算:

按照樣本質(zhì)量計(jì)算根系活力:以TTC的還原量來表示根系活力:

TTC還原強(qiáng)度[ μg TTC/(g·h)] =ΔA測定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V÷(W×T)

=5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

W:根重,g; C標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,20μg/mL;

T:反應(yīng)時(shí)間,4h; V:試劑五的體積即勻漿體積,1mL。

注意事項(xiàng):

1、試劑五容易揮發(fā),有毒,為了您的健康,請穿實(shí)驗(yàn)服,戴口罩,戴乳膠手套操作。

2、如果離心后待測的上清依然渾濁,可嘗試加大離心轉(zhuǎn)速或者延長時(shí)間,例如15000rpm 4℃離心 20min。


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