使用凱氏定氮法測定蜂王漿粗蛋白

1．原理     
  以濃硫酸消化分解蛋白質(zhì)，其中的氮變成氨，再與硫酸化合生成硫酸銨。生成的硫酸銨與氫氧化鈉反應(yīng)再生成氨，用蒸餾法使氨蒸出，用標(biāo)準(zhǔn)濃度的硫酸溶液與其反應(yīng)，剩余的硫酸再經(jīng)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，從實(shí)際消耗的酸量可推算出生成的氨量。 
2．儀器與試劑 
(1)儀器：分析天平(0.000 lg)、50ml凱氏燒瓶、凱氏定氮半微量蒸餾裝置1套、滴定裝置1套。 
(2)試劑： 濃硫酸（分析純，密度1.84）。 
硫酸銅與硫酸鉀混合試劑：稱取5水硫酸銅1g、硫酸鉀10g，置于研缽中混合均勻，研細(xì)備用。 
混合指示劑：量取0.1%次甲基紅乙醇溶液2份和0.1%溴甲酚綠乙醇溶液3份，臨用時(shí)混合。 
2%硼酸溶液：稱取硼酸2g，量取混合指示劑2ml、乙醇20ml，置于錐形瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至100ml，搖勻備用。 
40%氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉40g，加蒸餾水溶解并稀釋至100ml。

稀硫酸：量取濃硫酸5.7ml，加蒸餾水稀釋至100ml。 
0.01 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)酸溶液
3．測定方法 
(1)消化：準(zhǔn)確稱取蜂王漿樣品約1g，放入干燥的凱氏燒瓶內(nèi)，加入2g硫酸銅與硫酸鉀混合試劑，再沿瓶壁緩緩加入61ml濃硫酸，在瓶口放一小漏斗，使燒瓶成45°斜放，在通風(fēng)櫥內(nèi)置于電爐上加熱消化（先小火緩緩加熱，使溶液溫度保持在沸點(diǎn)以下，等暴沸停止后，逐步加大火力）。待消化液呈清澈的亮綠色后，再繼續(xù)加熱30min，消化即可完畢（消化時(shí)間約為lh），冷卻后備用。 
(2)蒸餾：量取2%硼酸溶液10ml置于100ml的錐形瓶中，加入混合指示劑2滴和少量稀硫酸，將冷凝管頂端浸入液面下。然后，將凱氏燒瓶中的消化液經(jīng)由漏斗移人蒸餾器中，用少量蒸餾水淋洗凱氏燒瓶和玻璃漏斗數(shù)次。向蒸餾器中加入40%氫氧化鈉溶液約25ml之后，再加入5ml蒸餾水（一半流入蒸餾器，一半在玻璃杯中作水封）。用調(diào)溫電爐加熱開始蒸餾。待錐形瓶內(nèi)溶液的顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)綠色時(shí)，繼續(xù)蒸餾10min，將冷凝管頂端提出液面，使蒸汽繼續(xù)沖洗1 min，用少量蒸餾水淋頂端，停止蒸餾。 
(3)滴定：用0.01 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定錐形瓶中吸收的氨量，滴定至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛易霞t色為終點(diǎn)，并作空白試驗(yàn)校正。 
4．計(jì)算       

式中：

      V1——樣品消耗標(biāo)準(zhǔn)酸溶液的體積，mL；

      V2——空白消耗標(biāo)準(zhǔn)酸溶液的體積，mL；

      N——標(biāo)準(zhǔn)酸溶液標(biāo)定的當(dāng)量濃度，mol/L；

      0.014——1N標(biāo)準(zhǔn)酸溶液1mL相當(dāng)于氮克數(shù)；

      F——蛋白質(zhì)系數(shù)，蛋白制品為6.25；

      m——樣品的質(zhì)量，g；

      D——樣品的稀釋倍數(shù)。

平行實(shí)驗(yàn)允許誤差不超過±2%，取平均值確定結(jié)果。
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