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工作原理：
總 cRaf 檢測原理：
總 cRaf 檢測用于量化細胞裂解物中 cRaf 的表達水平。與蛋白質(zhì)印跡法不同，該檢測基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉(zhuǎn)膜?？?cRaf 檢測使用兩種標記抗體，一種與供體熒光團偶聯(lián)，另一種與受體偶聯(lián)。這兩種抗體對蛋白質(zhì)上不同的表位具有高度特異性。在細胞提取物中存在 eNOS 的情況下，加入這些偶聯(lián)物會使供體熒光團與受體緊密接近，從而產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號。其強度與樣品中存在的蛋白質(zhì)濃度直接成正比，并在無需洗滌的檢測形式下提供了一種評估蛋白質(zhì)表達的方法。

總 cRaf 雙板檢測方案：
雙板方案涉及在 96 孔板中培養(yǎng)細胞，然后進行裂解。接著將裂解物轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積檢測板中，之后加入 HTRF 總 cRaf 檢測試劑。該方案能夠監(jiān)測細胞的活力和融合度。

總 cRaf 單板檢測方案：
使用 HTRF 試劑檢測總 eNOS 可以在一個用于培養(yǎng)、刺激和裂解的單板上進行。無需洗滌步驟。這個為高通量篩選設(shè)計的方案能夠?qū)崿F(xiàn)微型化，同時保持強大的 HTRF 質(zhì)量。

檢測驗證：
在 TPA 刺激的 HeLa 細胞中檢測總 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）：
HeLa 細胞以 100 微升的體積接種在 96 孔板中（每孔 100,000 個細胞），使用培養(yǎng)基并在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過夜。第二天，移除培養(yǎng)基，加入 50 微升無血清培養(yǎng)基，在 37°C、5% 二氧化碳的條件下使細胞饑餓 5 小時。然后用 50 微升不斷增加濃度的 TPA 在 37°C、5% 二氧化碳的條件下處理細胞 15 分鐘。

移除培養(yǎng)基后，用 50 微升補充裂解緩沖液 #2 在室溫下輕輕振蕩裂解細胞 30 分鐘，然后將 16 微升裂解物轉(zhuǎn)移到低體積白色微孔板中，再加入 4 微升預(yù)混的 HTRF 磷酸化 cRaf（Ser43）或總 cRaf 檢測試劑。孵育過夜后記錄 HTRF 信號。

在 TPA 刺激的 HEK293T 細胞中檢測總 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）：
HEK293T 細胞以 100 微升的體積接種在 96 孔板中（每孔 100,000 個細胞），使用培養(yǎng)基并在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過夜。第二天，移除培養(yǎng)基，加入 50 微升無血清培養(yǎng)基，在 37°C、5% 二氧化碳的條件下使細胞饑餓 5 小時。然后用 50 微升不斷增加濃度的 TPA 在 37°C、5% 二氧化碳的條件下處理細胞 15 分鐘。

移除培養(yǎng)基后，用 50 微升補充裂解緩沖液 #2 在室溫下輕輕振蕩裂解細胞 30 分鐘，然后將 16 微升裂解物轉(zhuǎn)移到低體積白色微孔板中，再加入 4 微升預(yù)混的 HTRF 磷酸化 cRaf（Ser43）或總 cRaf 檢測試劑。孵育過夜后記錄 HTRF 信號。

簡化的通路：
RSK1 的功能和調(diào)節(jié)：
RAF 原癌基因絲 / 蛋白激酶（c-RAF）是 MAP 激酶通路的一部分，它將上游效應(yīng)物 Ras 與下游 MAPK/ERK 級聯(lián)連接起來。因此，它在包括增殖、分化、凋亡、存活和致癌轉(zhuǎn)化在內(nèi)的細胞命運決定中發(fā)揮作用。

c-RAF 通過 PKC 的直接或間接作用在 Ser338 位點磷酸化而被激活，或者通過與 GTP 結(jié)合的 Ras 直接激活。通過 MAPK/ERK 依賴性反饋在 Ser43 位點磷酸化確保其失活。