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檢測原理：在 HTRF 相互作用檢測中，一個部分（直接或間接）用供體標(biāo)記，另一部分用受體標(biāo)記（同樣直接或間接）。信號強度與兩部分的結(jié)合成正比。在此處所示的例子中：單克隆抗體 Anti FLAG M2 - XL665 與帶 FLAG M2 標(biāo)簽的A部分結(jié)合，而B 部分* 與用 HTRF 供體標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合。 B部分*也可以是化的、帶標(biāo)簽的、Fc 融合的。在這些情況下，使用相應(yīng)的用供體標(biāo)記的 HTRF 試劑（抗標(biāo)簽、抗物種、蛋白 A、鏈霉親和素）進行檢測。

檢測方案：右側(cè)的例子描述了使用 20µL 最終檢測體積來檢測帶 FLAG M2 標(biāo)簽的A部分和未帶標(biāo)簽的B部分* 之間相互作用的方案。分配兩個部分（10µL），孵育，加入單克隆抗體 Anti FLAG M2 - XL665（5µL）和用供體標(biāo)記的抗B部分（5µL），孵育并讀取。* B部分也可以是化的、帶標(biāo)簽的、Fc 融合的或直接標(biāo)記的。在這些情況下，使用相應(yīng)的用供體標(biāo)記的 HTRF 試劑（抗標(biāo)簽、抗物種、蛋白 A、鏈霉親和素）進行檢測。

檢測細節(jié)：

為特定應(yīng)用構(gòu)建 HTRF 相互作用檢測：試劑按測試次數(shù)（20µL 反應(yīng)）出售。與 XL665 或 d2 偶聯(lián)的抗體以每孔 20ng 抗體的量供應(yīng)。還提供每瓶中的活性部分量（以及每瓶中的示蹤劑數(shù)量 - 見產(chǎn)品說明表）?；钚圆糠侄x為結(jié)合物（例如抗體）的活性部分。

測試次數(shù)與活性部分的關(guān)系：每孔的平均結(jié)合物數(shù)量反映了總體生物材料含量。通常優(yōu)選使用活性部分的量而不是總結(jié)合物的量。對于穴狀化合物和 d2 結(jié)合物，總結(jié)合物的量等于活性部分的量，因為標(biāo)記的分子量可以忽略不計。對于用 XL665 標(biāo)記的實體，總結(jié)合物的量將根據(jù) XL665 結(jié)合物的最終摩爾比而變化，然而，Revvity 提供的活性部分的量是恒定的，并且基于訂購的測試次數(shù)。
標(biāo)記 / 物種抗體活性部分 / 5000 次測試物種和亞型特異性 FLAG® 單克隆抗體 M2 5 - 10µg 小鼠 IgG1 DYKDDDDK 肽。

推薦的穴狀化合物和 XL665 結(jié)合物的量：穴狀化合物結(jié)合物不能過量，以防止讀數(shù)器飽和和不可接受的背景水平。在大多數(shù)情況下，1 到 5nM 的穴狀化合物濃度是合適的，并且根據(jù)所使用的與 HTRF 兼容的讀數(shù)器，在 620nm 處將產(chǎn)生 20000 到 80000 cps。XL665 結(jié)合物必須盡可能與其檢測對應(yīng)物匹配，以便最大數(shù)量的生物分子被 XL665 受體標(biāo)記。因此，要檢測濃度為 20nM 的帶標(biāo)簽分子，抗標(biāo)簽 - XL665 的濃度應(yīng)是等摩爾或更高。