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Eclipse Plus C8柱改進(jìn)藥物HPLC分析的峰形和效率
閱讀:788 發(fā)布時間:2023-5-5引言由于沒有一種柱子可以適用于所有分析,所以人們一直在研究新的HPLC液相色譜柱技術(shù)。科學(xué)家們一直都在尋找有助于創(chuàng)新、提高效率,并更快獲得良好結(jié)果的更好、更快的方法。例如,在制藥行業(yè),藥物的研究和開發(fā)需要更高效的色譜柱,以增加在一定時間內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確分析的數(shù)量。更快地篩選出潛在的藥物非常有意義。另外,政府和行業(yè)規(guī)范對儀器和技術(shù)的要求也越來越嚴(yán)格。用于食品的來自空氣和水(水,空氣和食品中)的每一種物質(zhì)都要嚴(yán)格檢查其質(zhì)量和安全性。高質(zhì)量HPLC柱是耐用的儀器和方法的必要組成部分,有了所有這些,才能獲得可靠的結(jié)果。ZORBAX Eclipse Plus C8 柱有幾種填料粒徑和柱尺寸,是提高效率的良好工具。它們分離酸性、中性和堿性化合物都有良好的峰形。是方法開發(fā)的色譜柱。
Eclipse Plus C8的選擇性色譜柱的選擇要考慮到一些因素。選擇性是進(jìn)行色譜柱選擇最重要的因素之一。選擇性系數(shù)(α)是兩個峰的相對保留值:α = k2 / k1在這里 k2 和 k1 分別是第二個洗脫出來的峰和第一峰的保留因子,也稱容量因子。如果這兩個峰一起被洗脫,α 為 1 ;對這兩個緊密相鄰的峰來說,選擇性接近1。選擇性,或峰間距,可以通過改變溫度、流動相或固定相(色譜柱)進(jìn)行調(diào)節(jié)。因為選擇性體現(xiàn)了分析物與固定相/流動相之間的相互作用,所以難以理解、也很難預(yù)測,常常需要通過實驗進(jìn)行優(yōu)化。有各種柱子可供選擇,這是改變α的有力而容易的辦法,尤其是因穩(wěn)定性、溶解度、pH 或其它局限無法改變流動相時。圖1顯示了在同樣的色譜條件下,EclipsePlus C8柱、Eclipse Plus C18 柱,和 Eclipse XDBC8 柱的不同選擇性。Eclipse Plus C8 柱與 EclipseXDB-C8 柱相比,雖然對三種非常難分離的化合物來說,α僅改變了6%,但分離度增加了1倍,從1.23增至2.42。
這些柱子都有相似之處,如,同樣以ZORBAX硅膠為基質(zhì),都采用的是安捷倫控制的生產(chǎn)技術(shù),因此,可以預(yù)計其洗脫順序也比較相似,如圖所示。但它們之間也有明顯的不同,例如,Eclipse Plus柱和Eclipse XDB柱采用的硅膠處理和鍵合技術(shù)不同,C18和C8的官能團(tuán)也不同。這些差異反映為選擇性的不同,進(jìn)而將改善分離度。對于a接近1的緊密相鄰峰,a的微小變化將對分離度產(chǎn)生極大的影響,例如在這個例子中,a 從 1.07變?yōu)?.14,分離度就從1.15增加到2.42。
快速分離(RR)小粒徑的填料與大粒徑填料相比,優(yōu)勢就是有更高的柱效。用這一特點可以明顯提高效率。填充了小粒徑填料的較短色譜柱,在保持了用長柱能得到的足夠分離度的同時,顯著加快了分析速度。圖3、4、5是應(yīng)用實例,用更短的高分離度快速(RR) (4.6 x 50 mm,3.5 µm)柱代替Eclipse Plus C8分析柱(4.6 x 150 mm,5 µm)。直接或“plug & play"替代都在保持足夠分離
度的同時,明顯縮短了分析時間,分析時間與柱長成正比。小粒徑填料柱還明顯提高了靈敏度。表1 列出了這三個例子中分析柱和 RR 柱分離時最后洗脫峰的峰高、峰面積和變化的百分比。由于進(jìn)樣量相等,用兩個柱子得到的峰面積都相同,但是RR柱的峰高(靈敏度測量[信噪比])卻要高 50%。三張圖中還列出了這些例子的系統(tǒng)反壓。RR柱因較小粒徑(3.5 vs. 5 µ)造成的高反壓問題,通過更短的柱長(50 vs. 150 mm)得到了彌補。分析柱(150 mm)和 50-mm RR 柱的反壓相等,證實了安捷倫RR柱的plug & play能力。所有的壓力都在安捷倫1100和1200系列液相色譜儀的操作范圍內(nèi)。如果需要,還可以選擇較高的流速,進(jìn)行更快的分析。Eclipse Plus C8柱有1.8、3.5和5 µm三種粒徑,適用于分析、高分離度快速和快速 LC 分析。表 2 列出了可供選擇的各種配置。
堿性化合物的出色峰形Eclipse Plus柱(C8和C18)的顯著的特點是分離各種類型樣品:酸性、堿性和中性樣品,都能得到出色的峰形。在上述例子的各圖中都列出了用美國藥典拖尾因子計算表示的峰形。每個例子中,都接近于理想狀態(tài)(1.0)。高性能+峰形,柱效和分離度+均歸功于全程嚴(yán)格控制的、改進(jìn)的硅膠生產(chǎn)和鍵合技術(shù)。堿性化合物(特別是含氨基的分子)的高效反相色譜分離經(jīng)常很困難。在低pH條件下(pH < 3),堿發(fā)生質(zhì)子化(BH+),因而水溶性很強,保留較差。在pH 7時,某些氨基可能仍然質(zhì)子化,而其它的則失去其質(zhì)子(B)。硅膠上沒有反應(yīng)硅醇基呈離子型(SiO-),將與質(zhì)子化的離子樣品發(fā)生相互作用。這種離子交換二級反應(yīng)將導(dǎo)致峰拖尾。在低 pH 條件下,硅醇基未離子化(SiOH),與堿性分析物不發(fā)生相互作用。圖6顯示了在pH 7時,同樣條件下分析2個堿性化合物的實例。這兩個已知化合物,阿密曲替林和右美沙芬,由于在中性 pH 條件下部分離子化,在 B 和 BH+之間互相轉(zhuǎn)化,用其它柱子分離時拖尾非常嚴(yán)重。但使用Eclipse Plus C8后,峰形非常好。Eclipse Plus進(jìn)行了ZORBAX硅膠處理、封端和鍵合,降低了離子化硅醇基的相互作用,顯著改善了峰形。