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摘要：本應(yīng)用報(bào)告內(nèi)容： • 建立了三七分析的高分離度快速液相色譜(RRLC)方法 • 從常規(guī) HPLC 到 RRLC 的方法轉(zhuǎn)換結(jié)果 • RRLC 方法的使用縮短了分析時(shí)間，同時(shí)保持了復(fù)雜組分的良好分離度，從而提高 了樣品通量，降低了成本 • 采用優(yōu)化的方法得到了三七植物不同部位的色譜圖，結(jié)果顯示其峰形和特定皂甙的 濃度各不相同

前言 中藥（TCM）在中國已有很長的歷史， 其療效被中國、韓國、日本等亞洲國家 廣泛認(rèn)可。西方國家也越來越普遍地將 中藥作為食品添加劑或營養(yǎng)品。隨著時(shí) 間的推移，已有 11000 多種中藥曾被使 用。中藥的研究和質(zhì)量控制十分依賴于 儀器分離，并要求很高的分離性能。 在本研究中，我們建立了一種分析三七 的高分離度快速液相色譜(RRLC)方法。用 安捷倫的方法轉(zhuǎn)換器可以將常規(guī) HPLC 方法輕松轉(zhuǎn)移至 RRLC。用不同的提取方 法制備三七植物不同部位的樣品。將這 些樣品用優(yōu)化的方法進(jìn)行分離，得到的 色譜圖顯示其具有不同的色譜峰形。本 應(yīng)用報(bào)告還顯示了定量結(jié)果。質(zhì)量控制 部門可以利用本研究開發(fā)更快、更好的 方法，縮短分析時(shí)間、提高樣品通量。 使用該方法還降低了溶劑成本，改善了 整個(gè)分析流程。 三七，在中國也稱田七，是一種重要而 昂貴的中藥。已栽培了約 400 年，85% 以上的三七產(chǎn)自中國的云南省。三七的 療效主要有活血化瘀、消腫止痛。最新 的 藥 理 學(xué) 研 究 表 明 ， 三 七 （ Panax notoginseng）具有抗癌和保肝作用，對(duì) 心腦血管系統(tǒng)也有保護(hù)作用［1］。三七的 皂甙圖譜與著名的人參(Panax ginseng) 和西洋參(Panax quinquefolium)非常相 似，因?yàn)樗鼈儗儆谕环N屬。三七主要用 于中國南方，有多種不同的中藥劑型。著 名的中藥制劑云南白藥和片仔癀都含有 三七。 中藥基質(zhì)的復(fù)雜一直是質(zhì)量控制和研究 的最大挑戰(zhàn)。中國藥典 2005 版列出了藥 材三七和中國藥物三七傷藥片，必須 對(duì)制劑中的三七皂甙 R1 成分進(jìn)行分析。 三七皂甙的一般分析時(shí)間為 60 分鐘以上。 隨著對(duì)中藥的研究越來越深入，科學(xué)家們 認(rèn)為僅控制一兩種組分還不足以確定中 藥的質(zhì)量，需要開發(fā)分離更多組分的質(zhì)量 控制方法。分離像中藥這樣的復(fù)雜樣品比 分離合成藥物需要更多的時(shí)間。當(dāng)樣品通 量也納入考量范圍的時(shí)候，理想的解決方 案就是用更短的時(shí)間得到相似或更好的 性能。采用 RRLC 可以開發(fā)分析時(shí)間更短、 性能更好的方法。RRLC 方法還有節(jié)省時(shí) 間和溶劑的優(yōu)勢(shì)。對(duì)生產(chǎn)質(zhì)量控制來說， 使用 RRLC 意味著新批次的產(chǎn)品可以比用 常規(guī) HPLC 方法更快出廠。

實(shí)驗(yàn)部分 儀器 用配置以下組件的 Agilent 1200 系列高 分離度快速液相色譜系統(tǒng)開發(fā) RRLC 方 法： Agilent 1200 系列 RRLC 系統(tǒng)包括： • 帶真空脫氣機(jī)的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵 • Agilent 1200 系 列 SL 型 高 效 自 動(dòng) 進(jìn) 樣器 • Agilent 1200 系列 SL 型柱溫箱 • Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢 測(cè)器，配備微量流通池（2 µL 體積，3 mm 光程） • Agilent 化學(xué)工作站 B.02.01 SR1 ，用于 數(shù)據(jù)采集和處理 • Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT 色譜 柱，4.6 x 50 mm，1.8 µm 粒徑 用包含以下組件的標(biāo)準(zhǔn)配置 Agilent 1100 系列液相色譜儀進(jìn)行常規(guī) HPLC 對(duì)比 實(shí)驗(yàn)： • 帶脫氣機(jī)的 Agilent 1100 系列二元泵 • Agilent 1100 系列自動(dòng)進(jìn)樣器 • Agilent 1100 系列柱溫箱 • Agilent 1100 系列二極管陣列檢測(cè)器 • Agilent ZORBAX SB-C18 色 譜 柱 ， 4.6 x 50 mm，5 µm 粒徑

樣品和樣品制備 • 三七皂甙 R1、人參皂甙 Rg1 和人參皂 甙 Rb1 標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢 定所(NICPBP)。人參皂甙 Re 和人參皂 甙 Rc 標(biāo)準(zhǔn)品購自美國 Sigma-Aldrich 公司 • 三七莖和葉提取物 (NCLE)由用戶實(shí)驗(yàn) 室友情贈(zèng)送。莖和葉用 60%乙醇萃取， 溶劑蒸干后，用正丁醇溶解殘?jiān)?，再?溶劑蒸干，殘留黃色粉末用甲醇溶解， 進(jìn)樣 • 三七根提取物 (NRE)由用戶實(shí)驗(yàn)室友情 贈(zèng)送。原始組分用水提取，經(jīng)大孔濾膜 過濾后，蒸干。殘留白色粉末用甲醇溶 解，進(jìn)樣 • 三七購自當(dāng)?shù)厮幉纳痰?。品牌為同仁堂?原料用水/甲醇 (30/70，v/v)提取，超聲 處理 30 分鐘，用 0.22 µm 濾膜過濾，用 澄明濾液進(jìn)樣 • 水、乙腈和甲醇均購自美國 Fisher 公司

方法轉(zhuǎn)換 使用 5 µm 粒徑填料色譜柱的常規(guī) HPLC 方法需要轉(zhuǎn)換為使用 1.8 µm 粒徑填料色 譜柱的 RRLC 方法。安捷倫的方法轉(zhuǎn)換器 （在 Agilent 1200 系列高分離度快速液相 色 譜 系 統(tǒng) 的 光 盤 上 ， 出 版 號(hào) 5989- 5130EN）可用于這一目的，轉(zhuǎn)換過程簡 便、快速（圖 1）。根據(jù)不同情況，轉(zhuǎn)換 后的方法可能需要按方法轉(zhuǎn)換器上列出的 不同參數(shù)做進(jìn)一步調(diào)整。如何將常規(guī) HPLC 方法手動(dòng)轉(zhuǎn)換成 RRLC 方法，可查 閱安捷倫的其它應(yīng)用報(bào)告[2,3,4] 。

結(jié)果與討論 色譜圖 藥理研究結(jié)果表明，由于組分不同，三 七植物的不同部位有不同療效。為了獲 得更多有效的成分，我們采用了各種特 殊提取方法。三七樣品用常規(guī) HPLC 方 法和 RRLC 方法分析得到了不同的峰形圖。 圖 2 顯示了用常規(guī) HPLC 方法分析的三 七莖和葉提取物（NCLE）的色譜圖。通 常此類分離需要 60 分鐘以上[5] 。如實(shí)驗(yàn) 部分所述，分析三七樣品的 RRLC 方法是根據(jù)常規(guī) HPLC 方法開發(fā)的。同樣的 NCLE 樣品分別采用常規(guī) HPLC 方法和 RRLC 方法 1。色譜圖見圖 2 和圖 3。圖 3 的色譜峰比圖 2 的峰窄，這說明提高了 復(fù)雜樣品的峰容量。RRLC 分析的分離度 或分離性能比常規(guī) HPLC 更好。同時(shí)分 析時(shí)間從 60 分鐘縮短到 20 分鐘。另一 個(gè)應(yīng)當(dāng)關(guān)注的因素是常規(guī) HPLC 和 RRLC 的色譜柱選擇性應(yīng)保持一致。如果新 RRLC 柱具有和常規(guī) HPLC 柱不同的 選擇性，轉(zhuǎn)換方法將失去意義。本研究中 的峰形和洗脫順序都相同，因而沒有必要 再確認(rèn)新色譜圖中的色譜峰。另外，二極 管陣列檢測(cè)器的 UV 光譜圖也有助于進(jìn)一 步確證。

圖 4 顯示了用 RRLC 方法 2 分析 NCLE 樣 品 所 得 的 色 譜 圖 。流 速 提 高 到 1.5 mL/min，縮短了分析時(shí)間。同時(shí)還保持 了與圖 3 結(jié)果相同或相當(dāng)?shù)男阅?。?duì)于 復(fù)雜樣品，縮短分析時(shí)間意味著損失峰容 量。因此，用戶應(yīng)權(quán)衡峰容量和分析時(shí)間 做出選擇。 如實(shí)驗(yàn)部分所述，三種樣品取自不同部位。 圖 5 為用 RRLC 方法 1 分析三七根提取 物（NRE）樣品的色譜圖。該樣品采用不 同的步驟從三七根中提取的。色譜峰形顯 示 NRE 和 RCLE 含有不同種類的皂甙和 其它成分。為了檢驗(yàn)我們建立的 RRLC 方 法能否用于其它三七樣品的分析，我們?cè)?當(dāng)?shù)刂兴幍曩徺I了三七，品牌為同仁堂， 藥店已經(jīng)把這種三七制成了粉末。對(duì)該三 七樣品分析的色譜圖見圖 6 和圖 7。圖 6 中的色譜圖為采用 RRLC 方法 1 所得，圖 7 采用的是 RRLC 方法 3。與需要 60 分 鐘以上分析時(shí)間的常規(guī) HPLC 方法相比， 圖 7 中的色譜圖顯示 4 分鐘即可完成分 析。三七莖和葉提取物比所分析的其它樣 品更復(fù)雜，使用 RRLC 方法 1 或 2 在保 證分離度的同時(shí)節(jié)省了分析時(shí)間。對(duì)于像 同仁堂三七提取物這樣不太復(fù)雜的樣品， 可以用更快速方法在較短的時(shí)間內(nèi)完成分 析，如圖 7 所示。

定量結(jié)果 用 RRLC 方法 2 分析了實(shí)驗(yàn)部分列出的 標(biāo)準(zhǔn)品。采用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立校正 曲線，測(cè)定三個(gè)樣品的濃度。定量結(jié)果見 表 2。NCLE 含有許多種類的皂甙，但不 含 Rc 或 Re。NRE 含皂甙的種類較少， 但卻包含了本研究所分析的 5 種標(biāo)準(zhǔn)品。 同仁堂三七提取物不含多種皂甙，也不含 Rc 或 Re。R1、Rb1 和 Rg1 的含量高于 NCLE 和 NRE。所有樣品中三七 R1 的濃 度為 0.029 到 0.89 µg/µL。本研究中建立 的定量方法可用于對(duì)不同方法提取的三 七進(jìn)行質(zhì)量控制。

結(jié)論 中藥是復(fù)雜的天然產(chǎn)物，用常規(guī) HPLC 方法分析需要高性能的系統(tǒng)和較長的分 析時(shí)間。本研究所建立的 RRLC 方法顯示 了如何在保持復(fù)雜組分良好分離度的同 時(shí)縮短分析時(shí)間。色譜圖顯示不同三七提 取物樣品有不同的色譜峰形。如果將應(yīng)用 需求考慮在內(nèi)，還可以采用更快流速的 RRLC 獲得更快速的分析方法。本研究中 所建立的定量方法可輕松用于三七產(chǎn)品 的質(zhì)量控制。采用 RRLC 方法保持或提高 了性能，同時(shí)大大縮短了分析時(shí)間，從而 增加了樣品通量、降低了成本。