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原始文獻(xiàn)：

Zhang, X., Kim, J., & Tonegawa, S. (2020). Amygdala Reward Neurons Form and Store Fear Extinction Memory.Neuron, 105(6).

恐懼消退需要形成新的印跡（engram）細(xì)胞。
恐懼消退印跡細(xì)胞存在于基底外側(cè)杏仁核的Ppp1r1b+神經(jīng)元中。
恐懼消退印跡細(xì)胞和獎(jiǎng)賞相關(guān)神經(jīng)元是高度重疊的，功能上相互轉(zhuǎn)換。
恐懼消退記憶是一種獎(jiǎng)賞記憶——期望中有害刺激的缺失是一種獎(jiǎng)賞。

 

恐懼行為是神經(jīng)科學(xué)研究中的一個(gè)重要課題。在模式動(dòng)物上研究恐懼行為的一個(gè)常見方法就是利用恐懼條件反射，即同時(shí)給予動(dòng)物無害刺激（條件刺激，CS）和有害刺激（非條件刺激，US），使動(dòng)物對(duì)無害刺激形成條件反射。恐懼記憶形成后，長(zhǎng)時(shí)間給予動(dòng)物單純的條件刺激能夠使動(dòng)物的恐懼條件反射減弱，這被稱作恐懼消退（fear extinction）。杏仁核（amygdala）被認(rèn)為是一個(gè)與恐懼密切相關(guān)的腦區(qū)。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基底外側(cè)杏仁核（basolateral amygdala，BLA）中存在兩類神經(jīng)元，Ppp1r1b+神經(jīng)元和Rspo2+神經(jīng)元（根據(jù)特定的基因表達(dá)區(qū)分），它們分別對(duì)正價(jià)刺激和負(fù)價(jià)刺激起反應(yīng)，并且相互間存在拮抗作用。本文的作者就試圖研究Ppp1r1b+神經(jīng)元在恐懼消退中的作用。

研究人員以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象采用了一個(gè)環(huán)境依賴的恐懼消退范式。實(shí)驗(yàn)組小鼠在第yi天在實(shí)驗(yàn)籠中接受三個(gè)周期的電刺激，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生恐懼記憶。第二天小鼠仍被放入實(shí)驗(yàn)籠中，但不再有電刺激，以此進(jìn)行恐懼消退的訓(xùn)練。第三天小鼠再一次被放入無電刺激的實(shí)驗(yàn)籠中進(jìn)行測(cè)試。另外有兩個(gè)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)：無恐懼消退訓(xùn)練的NonExt組和始終無電刺激的NonShock組。實(shí)驗(yàn)組和NonExt組在第Yi天實(shí)驗(yàn)中，恐懼表現(xiàn)（freezing）逐漸明顯；經(jīng)過第二天的消退訓(xùn)練后，實(shí)驗(yàn)組的恐懼程度顯著低于NonExt組，而NonShock組的恐懼表現(xiàn)始終處于極低的水平。

研究人員隨即對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠腦組織進(jìn)行了單分子熒光原位雜交（smFISH）來檢測(cè)Fos、Rspo2、Ppp1r1b的表達(dá)情況。熒光結(jié)果顯示，Rspo2+神經(jīng)元的活性在仍具有恐懼記憶的NonExt組小鼠中顯著，而在實(shí)驗(yàn)組和NonShock組小鼠中沒有顯著區(qū)別；Ppp1r1b+神經(jīng)元僅在發(fā)生了恐懼消退的實(shí)驗(yàn)組小鼠中被激活。

 

接下來研究人員又利用顯微內(nèi)窺鏡進(jìn)行在體鈣成像追蹤Rspo2+神經(jīng)元和Ppp1r1b+神經(jīng)元在恐懼消退實(shí)驗(yàn)期間的激活動(dòng)態(tài)。Rspo2+神經(jīng)元在第Yi天受到電刺激時(shí)（恐懼習(xí)得）以及第二天剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)籠時(shí)（恐懼取回）活性上升，在恐懼消退過程中及第三天的測(cè)試中活性降低。Ppp1r1b+神經(jīng)元?jiǎng)t剛好相反，在恐懼消退過程中及恐懼消退后具有高活性。研究者也發(fā)現(xiàn)，在恐懼習(xí)得中被激活的Rspo2+神經(jīng)元，大多會(huì)在恐懼取回時(shí)被再度激活；而在恐懼消退過程中被激活的Ppp1r1b+神經(jīng)元，也大多會(huì)在第三天的恐懼消退測(cè)試中被再度激活。鈣成像的結(jié)果與c-Fos一致，反映了Ppp1r1b+神經(jīng)元在恐懼消退中被激活，而恐懼激活的Rspo2+神經(jīng)元在恐懼消退中活性受抑制。

 

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研究人員分別向Rspo2-Cre小鼠和Ppp1r1b-Cre小鼠中注射攜帶有ChR2或eArchT的Cre依賴AAV病毒，特異性標(biāo)記并操縱Rspo2+神經(jīng)元和Ppp1r1b+神經(jīng)元。光遺傳實(shí)驗(yàn)顯示，在恐懼消退期間激活Rspo2+神經(jīng)元或抑制Ppp1r1b+神經(jīng)元能夠顯著降低恐懼消退的程度，而激活Ppp1r1b+神經(jīng)元或抑制Rspo2+神經(jīng)元可以促進(jìn)恐懼消退（加速習(xí)得過程），但對(duì)恐懼消退的終結(jié)果沒有影響。在恐懼消退習(xí)得完成后（第三天測(cè)試時(shí)）抑制Ppp1r1b+神經(jīng)元可以逆轉(zhuǎn)消退學(xué)習(xí)的結(jié)果，但激活該神經(jīng)元?jiǎng)t無顯著影響。光遺傳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步表明了這兩類神經(jīng)元在恐懼消退中的拮抗作用，以及Ppp1r1b+神經(jīng)元在恐懼消退的記憶中的重要作用。

研究人員接下來開始探究能否在pBLA的Ppp1r1b+神經(jīng)元中找到恐懼消退的印跡（engram）細(xì)胞。研究人員向Ppp1r1b-Cre小鼠的pBLA中注射了下圖所示的AAV病毒，使他們能夠在特定時(shí)間標(biāo)記上激活了的Ppp1r1b+神經(jīng)元并對(duì)其進(jìn)行遺傳操作。已經(jīng)恐懼消退完成的小鼠在第三天的測(cè)試時(shí)激活的Ppp1r1b+神經(jīng)元被標(biāo)記并轉(zhuǎn)入ChR2。這些小鼠再一次經(jīng)歷了三天的恐懼消退實(shí)驗(yàn)，而光激活上述被標(biāo)記的Ppp1r1b+神經(jīng)元能夠顯著提升恐懼消退的速度。對(duì)Rspo2+神經(jīng)元進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)則沒有任何顯著結(jié)果。利用同樣的方法，向被標(biāo)記的Ppp1r1b+神經(jīng)元中轉(zhuǎn)入ArchT，光抑制這些Ppp1r1b+神經(jīng)元可以顯著逆轉(zhuǎn)恐懼消退的結(jié)果，并且Rspo2+神經(jīng)元的活性顯著提高。這些結(jié)果表明，恐懼消退記憶的印跡細(xì)胞確實(shí)存在于Rspo2+神經(jīng)元中，這些印跡細(xì)胞對(duì)恐懼消退記憶的維持其中重要的作用，并且能夠抑制與恐懼有關(guān)的Rspo2+神經(jīng)元的活動(dòng)。

摘自原文Fig4，只有被激活并且表達(dá)Ppp1r1b的神經(jīng)元會(huì)被轉(zhuǎn)入ChR2-EYFP／EYFP，并且該序列的表達(dá)可以通過給小鼠喂食doxycycline (Dox)進(jìn)行抑制，因此研究人員可以標(biāo)記上特定時(shí)間的目標(biāo)神經(jīng)元。

之前的研究表明，pBLA中的Ppp1r1b+神經(jīng)元有一部分對(duì)飲食獎(jiǎng)賞有反應(yīng)，研究人員接下來研究了這兩種Ppp1r1b+神經(jīng)元間的關(guān)系。小鼠被禁水一天后再給予飲水獎(jiǎng)賞，研究人員用病毒注射標(biāo)記上了對(duì)獎(jiǎng)賞起反應(yīng)的Ppp1r1b+神經(jīng)元。小鼠接下來被分為四組，分別進(jìn)行禁水+給水，禁食+給食，恐懼消退，恐懼（無消退，即NonExt組）的實(shí)驗(yàn)。研究人員隨即檢測(cè)了c-Fos表達(dá)情況，結(jié)果顯示，飲水獎(jiǎng)勵(lì)、進(jìn)食獎(jiǎng)勵(lì)和恐懼消退的三組小鼠之間，被標(biāo)記的Ppp1r1b+神經(jīng)元中表達(dá)c-Fos的比例和表達(dá)c-Fos的神經(jīng)元中被標(biāo)記的比例都沒有顯著差異，但都顯著高于NonExt組。這一結(jié)果顯示對(duì)獎(jiǎng)賞起反應(yīng)的Ppp1r1b+神經(jīng)元與恐懼消退相關(guān)的Ppp1r1b+神經(jīng)元有著很高的重疊度。動(dòng)態(tài)的鈣成像實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明了這一結(jié)果。

研究人員還用神經(jīng)元被標(biāo)記/遺傳操作的小鼠進(jìn)行了光遺傳自我刺激行為測(cè)試（optogenetic self-stimulation behavior test）和光遺傳實(shí)時(shí)空間偏好測(cè)試（optogenetic real-time place preference test）。無論是通過飲水獎(jiǎng)勵(lì)還是恐懼消退標(biāo)記上Ppp1r1b+神經(jīng)元的小鼠，都有相當(dāng)一部分表現(xiàn)出了自我刺激行為或空間偏好（即有主動(dòng)激活Ppp1r1b+神經(jīng)元的偏好）。而光激活通過飲水獎(jiǎng)勵(lì)標(biāo)記/遺傳操作的Ppp1r1b+神經(jīng)元也能夠提高恐懼消退的速度。這些結(jié)果進(jìn)一步表明了與恐懼消退相關(guān)的和與飲食獎(jiǎng)賞相關(guān)的Ppp1r1b+神經(jīng)元是高度相關(guān)的，恐懼消退在神經(jīng)元水平上可以被認(rèn)為是一種獎(jiǎng)賞。

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