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引物的合成及純化方式
閱讀：1716 發(fā)布時間：2022-10-24目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺y三酯法。該方法具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應物比較穩(wěn)定的特點。主要是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。
固相亞磷酰胺三酯法合成引物的具體步驟如下：
1) 用三lv乙酸去除固相載體5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基；
2) 將亞磷酰胺保護核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，與游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應；
3) 由于無法*的5'-羥基都參與縮合，可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(少于2%)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑試劑將其終止合成，這種短片段可以在純化時分離掉；
4) 在氧化劑的作用下，亞磷酰形式轉變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更穩(wěn)定。
經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸就被連接到固相載體上。重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基連接完成。合成過程中可以監(jiān)控脫下的保護基團DMT的顏色可以初步判定合成效率。
引物純化方式選擇：
1、C18柱脫鹽：
有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。
2、OPC純化：
OPC純化是根據DNA保護基（DMTr基）和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化。
3、PAGE純：
PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。
4、HPLC純化：
HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量效率不高。