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當(dāng)“連續(xù)流技術(shù)”遇上“生物催化”：生產(chǎn)手性氨基酸
【Ingenza案例】當(dāng)“連續(xù)流技術(shù)”遇上“生物催化”：生產(chǎn)手性氨基酸
【背景介紹】
生物催化是一種利用酶或者生物有機(jī)體做為催化劑進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化的技術(shù)，由于其作用條件綠色、溫和，并且對(duì)反應(yīng)底物具有的選擇性，因此在有機(jī)合成特別是手性分子的合成中具有*的優(yōu)勢(shì)，是近年來綠色有機(jī)化學(xué)合成技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。
生物催化為什么可以如此的實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的立體選擇性的呢？這與生物催化反應(yīng)的本質(zhì)有關(guān)。我們都知道，酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)是具有一定構(gòu)象的。因此，在生物反應(yīng)中，首先需要酶與小分子底物結(jié)合，而這則需要小分子的底物與酶提供的催化位點(diǎn)的構(gòu)象十分吻合。這就好像是一把“鑰匙”配一把“鎖”一樣，符合催化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的底物就可以進(jìn)入到酶的催化口袋中，就像鑰匙開啟了一把鎖一樣，催化反應(yīng)就會(huì)啟動(dòng)。而結(jié)構(gòu)不匹配的底物就像是一把錯(cuò)誤的鑰匙，無法被酶催化。而當(dāng)參與反應(yīng)的多種底物均與酶結(jié)合后，由于酶限制了這些底物的相對(duì)空間位置，因此這些底物只能按照特定的空間方向進(jìn)行反應(yīng)。這就體現(xiàn)了酶催化化學(xué)反應(yīng)中的立體選擇性。
酶催化反應(yīng)一般通過拆分法或者轉(zhuǎn)化法得到光學(xué)純的化合物。拆分法(Biocatalytic Resolution)是利用酶對(duì)于外消旋體中一對(duì)對(duì)映構(gòu)識(shí)別結(jié)合能力不同進(jìn)行拆分的（如圖1a）。比方說在非天然氨基酸（UAAs）的合成中，氨基酸根據(jù)α-碳原子的手性不同，分為D-氨基酸和L-氨基酸。氨基酸消旋體（D:L=50:50）是很易制得的，可通過D-氨基酸氧化酶從消旋體拆分出其中的非天然L-氨基酸。因?yàn)镈-氨基酸氧化酶只能識(shí)別D-氨基酸，將其氧化為α-酮酸，而不能與L-氨基酸發(fā)生反應(yīng)。因此，通過D-氨基酸氧化酶的選擇性拆分，就將氨基酸的外消旋混合物轉(zhuǎn)化為酮酸和L-氨基酸的混合物，而這種混合物相較于一對(duì)異構(gòu)體往往是更易于分離的。即通過這樣的方式，將非天然的L-氨基酸從消旋體中拆分出來（如圖1a）。
圖1. 生物催化反應(yīng)獲得手性異構(gòu)體的三種方法：a) 拆分法、 b)不對(duì)稱拆分法和 c)轉(zhuǎn)化法.
而拆分法分離得到的光學(xué)純異構(gòu)體往往高也只具有50%的收率，而另外50%往往被轉(zhuǎn)化成其他副產(chǎn)物（α-酮酸）被浪費(fèi)掉了，如果我們建立一種從副產(chǎn)物重新回到消旋體的一種策略，即實(shí)現(xiàn)了對(duì)異構(gòu)體的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分（Dynamic Kinetic Resolution, DKR），可以有效的把拆分的理論產(chǎn)率提高到100%。比方說在D-氨基酸氧化酶對(duì)氨基酸的拆分中，所產(chǎn)生的酮酸可以在鈀/碳的催化下被甲酸銨還原形成DL-氨基酸[2]。而其中的D-氨基酸可以繼續(xù)被D-氨基酸氧化酶選擇性的氧化生成酮酸，這樣形成的循環(huán)，就可以把消旋化合物全部轉(zhuǎn)化為光學(xué)純的L-氨基酸異構(gòu)體（如圖1b所示）。
通過酶催化轉(zhuǎn)化（Biotransformation）的方法得到光學(xué)純的化合物也是一種常用的方法。該方法是利用酶對(duì)于潛手性底物（achiral substrate）的不對(duì)稱催化從而得到的光學(xué)純異構(gòu)體。例如在非天然氨基酸的合成中，轉(zhuǎn)化法的應(yīng)用也很常見。酮酸就是一種合成非天然氨基酸的潛手性底物，L-氨基酸酸可以通過對(duì)酮酸的不對(duì)稱轉(zhuǎn)氨化制備而得（如圖1c所示）。比方說L-高丙氨酸可以通過2-氧代丁酸和芐胺為起始原料，在ω-轉(zhuǎn)氨酶的不對(duì)稱催化下合成，引入己烷作為反應(yīng)溶劑形成雙相體系可減少Benzaldehyde對(duì)酶的活性抑制，該反應(yīng)產(chǎn)率96%，e.e. >99%[3]。
生物催化由于其的選擇性，在不對(duì)稱催化合成領(lǐng)域具有很大的價(jià)值。但由于其較長(zhǎng)的反應(yīng)停留時(shí)間與多相反應(yīng)的特點(diǎn)，限制了其在連續(xù)流反應(yīng)中的應(yīng)用。而Coflore ATR攪拌器，作為一種動(dòng)態(tài)混合攪拌器，依靠攪拌器元件和反應(yīng)器本體的機(jī)械振動(dòng)進(jìn)行混合，不借助流體速度，就可以提供非常的混合效率，可以有效的解決連續(xù)流反應(yīng)中反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)又存在固體的問題，進(jìn)而有效地應(yīng)用于酶催化反應(yīng)中。
【連續(xù)流方案】
工業(yè)生物技術(shù)專家Ingenza在Roslin的生物中心與AM technology公司合作將連續(xù)流技術(shù)運(yùn)用于生物催化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)手性氨基酸的大規(guī)模的合成。相關(guān)成果發(fā)表在Org. Process Res. Dev.（dx.doi.org/10.1021/op2003612）雜志上。
D-氨基酸氧化酶拆分氨基酸是一個(gè)三相反應(yīng)（如圖1a所示），需要向丙氨酸溶液（液相）中，通入氧氣（氣相）氧化FAD輔酶循環(huán)，D-氨基酸氧化酶的全細(xì)胞凍干粉在反應(yīng)體系中又是一個(gè)固體（固相）。并且這個(gè)反應(yīng)需要充分?jǐn)嚢鑾讉€(gè)小時(shí)才可以完成。由此看來，Coflore ATR連續(xù)反應(yīng)器是適合于進(jìn)行此類反應(yīng)的。該反應(yīng)在1 mol/L的底物濃度條件下進(jìn)行（相當(dāng)于丙氨酸89.09 g/L）。首先將丙氨酸和酶懸濁液預(yù)混，再泵入ATR反應(yīng)器中，接著再將氧氣鼓入反應(yīng)管中（大規(guī)模反應(yīng)中則使用多個(gè)反應(yīng)管，氧氣則根據(jù)比例在反應(yīng)流的不同階段鼓入，反應(yīng)裝置如圖2所示），保持2Hz的反應(yīng)振速，考察了連續(xù)流反應(yīng)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率，并與釜式反應(yīng)的效果進(jìn)行了對(duì)比。
圖2. Coflore ATR反應(yīng)器的混合原理、裝置以及氣液混合圖. 圖片來源：Org. Process Res. Dev.
釜式反應(yīng)進(jìn)行三相反應(yīng)，其反應(yīng)的效果往往和氣體的傳質(zhì)效率有很大的關(guān)系。比方說在此例反應(yīng)中，轉(zhuǎn)速和反應(yīng)體積對(duì)反應(yīng)的結(jié)果非常大。轉(zhuǎn)速加快，氧氣的傳質(zhì)效率高，反應(yīng)的速度也會(huì)明顯加快。而當(dāng)反應(yīng)的規(guī)模增大時(shí)，反應(yīng)液的高度會(huì)有明顯的變化，會(huì)改變釜式反應(yīng)中氣液分布降低其混合效率，進(jìn)而使反應(yīng)速度大大的降低，并且反應(yīng)中酶的降解導(dǎo)致的反應(yīng)活性降低也是不容忽視的（可能與產(chǎn)生的雙氧水的蛋白毒性有關(guān)，如圖3所示）。因此，釜式反應(yīng)很難放大，這極大降低了其應(yīng)用價(jià)值。
圖3. 釜式反應(yīng)中轉(zhuǎn)速與規(guī)模對(duì)于反應(yīng)速率的影響. 圖片來源：Org. Process Res. Dev.
而Coflore ATR 反應(yīng)器是通過增加管道長(zhǎng)度來擴(kuò)大反應(yīng)規(guī)模，這不會(huì)改變混合兩相中的氣液分布。又因其的攪拌混合效率，使得在同等1L的反應(yīng)規(guī)模下，連續(xù)流是釜式反應(yīng)速率的三倍，當(dāng)增大到10L反應(yīng)時(shí)，連續(xù)流反應(yīng)的速率基本上不發(fā)生改變，并且節(jié)約了70%的氧氣（如圖4所示）。而且相對(duì)于普通的靜態(tài)混流反應(yīng)器而言，Coflore ATR 反應(yīng)器保持了在長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)進(jìn)程中一個(gè)很好的壓力降，并且避免了物料的堆積和堵塞，其對(duì)于反應(yīng)物的高混合效率依舊是其他類型反應(yīng)器*的。
圖4. 大規(guī)模反應(yīng)對(duì)于連續(xù)流反應(yīng)和釜式反應(yīng)效果的影響. 圖片來源：Org. Process Res. Dev.
【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】
- D-氨基酸氧化酶拆分氨基酸，其反應(yīng)速率與氧的吸收速率有很大關(guān)系，Coflore ATR 反應(yīng)器解決了傳統(tǒng)釜式反應(yīng)中混合效率低和保持氣液分布的均勻性的難題。行而有效的擴(kuò)大了反應(yīng)規(guī)模。
- 生物催化中酶的固體特性限制了其在連續(xù)流技術(shù)的使用，Coflore ATR 反應(yīng)器的動(dòng)態(tài)橫向混合使得全細(xì)胞催化與連續(xù)流技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)中的聯(lián)用成為可能。其避免了活細(xì)胞等有機(jī)體在設(shè)備中的堵塞問題，并提高了反應(yīng)規(guī)模和反應(yīng)速度。
- 生物催化與連續(xù)流技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用有助于降低工業(yè)生產(chǎn)中設(shè)備成本、操作成本和催化劑消耗，加快生產(chǎn)速度，具有深遠(yuǎn)而富有前景的應(yīng)用意義。
【參考文獻(xiàn)】
[1] dx.doi.org/10.1021/op2003612 | Org. Process Res. Dev. 2012, 16, 1013−1016
[2] US20080153137
[3] Biotechnol. Lett. 2009, 31, 1595-1599
深圳市一正科技有限公司，作為荷蘭Chemtrix公司（微通道反應(yīng)器）、英國(guó)AM公司（連續(xù)攪拌多級(jí)反應(yīng)器、催化加氫系統(tǒng)）、英國(guó)NiTech公司（連續(xù)結(jié)晶儀、連續(xù)合成儀）在中國(guó)區(qū)的代理商和技術(shù)服務(wù)商，為廣大高校和企業(yè)提供連續(xù)合成、在線萃取、連續(xù)結(jié)晶、在線過濾干燥、在線分析等整套連續(xù)工藝解決方案。
公司與復(fù)旦大學(xué)、南京大學(xué)、中山大學(xué)、華東理工大學(xué)、南京工業(yè)大學(xué)、浙江工業(yè)大學(xué)、河北工業(yè)大學(xué)等高校研究機(jī)構(gòu)合作成立微通道連續(xù)流化學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，致力于推動(dòng)連續(xù)流工藝在有機(jī)合成、精細(xì)化工、制藥行業(yè)、能源材料、食品飲料等領(lǐng)域的應(yīng)用，合作實(shí)驗(yàn)室可以為客戶的傳統(tǒng)間歇釜式工藝在連續(xù)流工藝上的轉(zhuǎn)變提供工藝驗(yàn)證、連續(xù)流工藝開發(fā)工作，促進(jìn)制藥及精細(xì)化工企業(yè)由傳統(tǒng)間歇工藝向綠色、安全、快速、經(jīng)濟(jì)的連續(xù)工藝轉(zhuǎn)變。
公司與荷蘭Chemtrix B.V.在浙江臺(tái)州、江蘇南京合作組建了連續(xù)流微通道工業(yè)化應(yīng)用技術(shù)中心（以下簡(jiǎn)稱“工業(yè)化技術(shù)中心”），旨在打造集連續(xù)流微通道工藝開發(fā)、中試試驗(yàn)、工業(yè)化驗(yàn)證、技術(shù)交流于一體的綜合性連續(xù)流微通道應(yīng)用技術(shù)服務(wù)中心，以為廣大生物醫(yī)藥企業(yè)、化工類企業(yè)提供專業(yè)、完善的智能化連續(xù)流工藝整套系統(tǒng)解決方案及技術(shù)服務(wù)方案。