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       C18這種固定相目前主導(dǎo)了HPLC柱市場，雖然不斷有新的固定相被創(chuàng)造出來推向市場，C18目前仍占有50-60%的市場。在USP數(shù)據(jù)庫中，收錄的L1有接近800種（L1主要是C18，也含有一些極性封端和極性嵌入的C18，點擊進入USP收錄的L1型色譜柱），而且這個數(shù)據(jù)在不斷增長。

       在我的實際工作中，有遇到不少由于使用不當(dāng)或者不可避免的因素而導(dǎo)致色譜柱峰形變差、柱效下降、柱壓升高等情況。色譜柱是一種耗材，肯定是有一定的壽命的，有些時候遇到這種情況，的成本（特別是儀器緊張時的時間成本）可能也挺高，而且不一定有效。

      據(jù)說在有些歐美藥企，為了保證數(shù)據(jù)重復(fù)性，色譜柱是規(guī)定了使用次數(shù)的，到使用次數(shù)了就換，不管柱子還能不能繼續(xù)使用。但是對于國內(nèi)，一支進口色譜柱的成本可能就是一個實驗人員半個月或者一個月的工資了，企業(yè)不得不考慮色譜柱的成本問題；另外對于很多經(jīng)費有限的高校的學(xué)生也是這樣，可能一支柱子要伴隨他/她的整個研究生歲月。有時候下班了還會接到他們焦慮的電話：我的柱子出問題了，還能不能搶救一下？

，我會讓他們給我?guī)讉€信息:

1. 色譜柱的背壓（backpressure）是否有明顯升高？在這里，建議使用者在新柱子開封后先按照柱報告的條件測試一下柱子，如果出現(xiàn)柱效或者保留時間等與柱報告上的數(shù)據(jù)差異較大，可以聯(lián)系供貨商進行售后；同時可以記錄下在這臺儀器上測試時的背壓情況，這就可以作為背壓升高情況的參考值；

2.是否所有的色譜峰都出現(xiàn)了拖尾或者變形（如肩峰或裂峰），如下圖:

圖一拖尾峰和變形峰

有幾種情況：

      1. 只出現(xiàn)現(xiàn)象1，即背壓升高。這種情況不一定是色譜柱的問題，那有可能是儀器體系出現(xiàn)了問題，比如某些管路出現(xiàn)不通暢；或者使用的流動相黏度過大（如異丙醇）、流速過大；也有可能是色譜柱老化了（這種情況下色譜柱的背壓是緩慢增加的）；或者使用了高濃度的緩沖鹽或者長時間把柱子保存在含有緩沖液的流動相中，這樣會導(dǎo)致鹽在色譜柱中析出而造成柱壓升高；

       2.只出現(xiàn)現(xiàn)象2，即所有峰都拖尾或者變形，而柱壓基本沒有上升。這種情況有可能是色譜柱安裝不當(dāng)，比如死體積過大或者柱子填充不好，出現(xiàn)柱床塌陷；也有可能色譜柱出現(xiàn)樣品過載了，這個時候可以檢查下進樣量是否過大；也有可能是分析物都是堿性化合物，流動相的pH不合適，這時可以調(diào)低pH以抑制填料中硅醇的活性或者增加緩沖液濃度以提高緩沖能力；當(dāng)然，也有可能是色譜柱的柱頭被強保留的物質(zhì)污染，這個時候可能會出現(xiàn)連續(xù)跑空白樣品時會在同樣的地方出峰的現(xiàn)象；

       3. 同時出現(xiàn)現(xiàn)象1和現(xiàn)象2，即色譜柱背壓明顯升高，同時色譜峰出現(xiàn)拖尾或者變形，這種情況很有可能是色譜柱的篩板堵了或者柱頭污染了。

       在這里，我再強調(diào)一遍，解決問題的辦法是預(yù)防問題的產(chǎn)生。出現(xiàn)色譜柱污染或者堵的情況很多時候是可以避免的，比如安裝在線過濾器或者保護柱等等，這里就不展開講了。下面講一下出現(xiàn)篩板堵了或者柱頭污染了怎么處理，有兩種方法：

      1. 把柱子反過來用。這并不適用于所有的柱子，因為有些柱子的兩端篩板的孔隙大小不一致，反沖可能把填料沖出來而造成柱床塌陷。根據(jù)經(jīng)驗，這個操作可以解決一部分色譜柱的峰拖尾或者變形的問題；

       2. 用強洗脫的溶劑沖洗。很多文獻數(shù)據(jù)認(rèn)為反相HPLC中溶劑強度順序為：水（弱）< 甲醇 < 乙腈 < 乙醇< si氫呋喃 < 丙醇 < 二氯甲烷（zui強），由于二氯甲烷很強，因此可用于清洗被強保留樣品組分污染的RPC柱。

      一般來說，反沖效果更好，這樣強保留成分就不需要走過整個色譜柱了。推薦的保守的清洗方法是：

1、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%沖洗柱子，以除去系統(tǒng)中可能殘存的緩沖鹽（如果確定系統(tǒng)中不含緩沖鹽此步驟可以略過）；

2、異丙醇低流速（至少減半）沖洗，沖洗的時間視情況而定；

3、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%

4、用所需的流動相比例重新平衡色譜柱。

      如果用保守的方法沒有什么效果，又不想放棄這支色譜柱，我這里有一個參考了好幾本專著的方法，其中用到了更強的流動相：

1、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%沖洗柱子，以除去系統(tǒng)中可能殘存的緩沖鹽（如果確定系統(tǒng)中不含緩沖鹽此步驟可以略過）；

2、20倍柱體積異丙醇低流速（至少減半）沖洗；

3、20倍柱體積的二氯甲烷：含0.1%氫氧化銨的甲醇=96%：4%沖洗柱子；

4、20倍柱體積異丙醇低流速（至少減半）沖洗；

5、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%

6.、用所需的流動相比例重新平衡色譜柱。

      關(guān)于二氯甲烷能不能進C18色譜柱的問題，我去問過有過這么操作的同行，有的說快速沖一下確實可以很好地清洗柱子，但也有反映說沖過之后柱效損失很大。所以本方法僅供準(zhǔn)備后再搶救一把的色譜柱來嘗試，嘗試完后麻煩也給我反饋下效果。這里有需要注意的是二氯甲烷和水是不互溶的，所以在使用二氯甲烷前后都需要用異丙醇充分過渡。

      后，關(guān)于柱體積的計算可以找到很多文章來詳細(xì)說明，這里就不贅述。附錄一個全多孔硅膠填料色譜柱的柱體積數(shù)據(jù)：