TOP10 Electro
TOP10 Electroporation-Competent Cell
產(chǎn)品規(guī)格:

TOP10 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞基因型：

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU  galK

rpsL (Strr)endA1 nupG

TOP10 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)簡要說明：

TOP10 電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。-CMbio-

TOP10 來源于 MC1061 菌株，是目前實驗室最常用的感受態(tài)細(xì)胞之一，基因型與 DH10B 高度類似 (DH10B 為 galE15 型，而 TOP10 為 galU 型)。TOP10 生長速度快 (比 DH5α快，但比 Mach1-T1 生長速度慢)，10 小時可見克隆。recA1 和 endA1 的突變有利于插入 DNA 的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒 DNA 的提取。可用于構(gòu)建克隆，藍白斑篩選等實驗，具有鏈 霉素抗性。-CMbio-

1. -CMbio-TOP10 電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19 質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達 1×1010 cfu/μg DNA。

TOP10 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)操作說明：

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5 分鐘，待其瀝干水分，正置 5 分鐘，使乙 醇充分揮

發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面 0.5 cm 以方便蓋上杯蓋，冰中 靜置 5 分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的 TOP10 電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中 5 分鐘，待其融化，加入目的 DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物) 并用手EP 管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。-CMbio-
A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對照質(zhì)粒  pUC19；-CMbio-

B. 對于連接產(chǎn)物，請用乙醇沉淀 DNA 后加入適量 TE 緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重 懸，DNA 濃 度不超過 100 ng/μl，體積不超過 5 μl/50 μl 感受態(tài)。-CMbio-
3. 用 200 μl 槍頭(用刀切除 0.5cm 槍尖)將感受態(tài)-DNA 混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為 BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用 電轉(zhuǎn)儀 推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。-CMbio-
5. 2 分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入 1ml 不含抗生素的無菌 S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用 1ml 槍吹吸電擊杯 底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到 50 ml 離心管（BD Falcon 50 ml 錐形離心管等），向離心管中 補加 S.O.C. 培養(yǎng)基至 10 ml。 傾斜 45 度放入搖床，37℃，225 rpm 復(fù)蘇 60 分鐘。-CMbio-
6. 5000 rpm 離心一分鐘收菌，重懸后取 100-200 μl 涂布到含相應(yīng)抗生素的 S.O.C 平板上（因菌量較大， 若全部涂 板請選用直徑 15cm 培養(yǎng)皿 2-5 個）。將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng) 13-17 小時。-CMbio

TOP10 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)注意事項：
1.  加入 DNA 時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的 1/10。 -CMbio-

2. 電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會增加弧光放電風(fēng)險。-CMbio-

3. 當(dāng) DNA 不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。-CMbio-

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和 DNA 的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險。

5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個 數(shù)量級。-CMbio-
6. 對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀 DNA 后用適量 TE 緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產(chǎn) 物，保證 DNA 濃度不超過 100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險。 7. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃

度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。-CMbio-

8. 電擊感受態(tài)細(xì)胞保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會下降。-CMbio-