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小反芻獸疫病毒酶聯(lián)抗體檢測(cè)試劑盒使用方法及注意事項(xiàng)
檢測(cè)原理
本試劑盒由預(yù)包被小反芻病毒重組蛋白的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物及其他配套試劑組成，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）原理檢測(cè)羊血清、血漿樣本中小反芻病毒抗體。實(shí)驗(yàn)時(shí)在酶標(biāo)板中加入對(duì)照血清和待檢樣本，經(jīng)溫育后若樣品中含有小反芻病毒抗體，則將與酶標(biāo)板上抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的其他成分后；再加入酶標(biāo)記物，與酶標(biāo)板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，在孔中加TMB底物液，與酶標(biāo)結(jié)合物反應(yīng)形成藍(lán)色產(chǎn)物，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成正相關(guān)；加入終止液終止反應(yīng)后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色；用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定各反應(yīng)孔中的吸光值，即可知樣品是否含有小反芻病毒抗體。
試劑盒組成
序號(hào) | 名稱(chēng) | 規(guī)格/96T×3 |
1 | 酶標(biāo)記物 | 12ml×3 |
2 | 樣品稀釋液 | 22ml×3 |
3 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml×3 |
4 | 底物液A | 6ml×3 |
5 | 底物液B | 6ml×3 |
6 | 終止液 | 12ml×3 |
7 | 陽(yáng)性對(duì)照 | 1.0 ml×3 |
8 | 陰性對(duì)照 | 1.0 ml×3 |
9 | 酶標(biāo)板 | 96T×3 |
10 | 封板膜 | 3 |
儲(chǔ)存及有效期
2～8℃保存，有效期12個(gè)月。
包被板開(kāi)封后請(qǐng)于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個(gè)月。
適用儀器
含450nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀，37℃恒溫設(shè)備，可調(diào)微量移液器。
樣品準(zhǔn)備
1.取動(dòng)物全血按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無(wú)溶血、無(wú)污染。樣品1周內(nèi)可于2～8℃保存，長(zhǎng)期需置-20℃保存。
2.用樣品稀釋液將待檢血清按50倍稀釋?zhuān)ㄈ?span style="font-size: 16px; font-family: 宋體;">4μl血清加入196μl樣品稀釋液中，混勻）陰性、陽(yáng)性對(duì)照不用稀釋。
3.濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋成工作洗滌液(如19份蒸餾水或去離子水加1份濃縮洗滌液)。
檢驗(yàn)方法
1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復(fù)至室溫。
2.取所需用量酶標(biāo)板條，設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照各1孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。
3.陰性、陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入陰性、陽(yáng)性對(duì)照100μl；樣品孔每孔加入稀釋后的樣品100μl。
4.混勻，蓋好蓋板膜，置37℃溫箱孵育30分鐘。
5.甩去孔內(nèi)液體，每孔加250ul工作洗滌液，用震蕩混勻的方式洗滌60秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，每次洗滌后需拍干液體。
6.每孔加酶標(biāo)記物100μl，置37℃避光反應(yīng)30分鐘。
7.甩去孔內(nèi)液體，每孔加250ul工作洗滌液，用震蕩混勻的方式洗滌60秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，每次洗滌后需拍干液體。
8.根據(jù)樣本數(shù)量將顯色液A與顯色液B按等體積比例混勻配置為底物工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。每孔加100ul，置37℃避光反應(yīng)10分鐘。
9.每孔加終止液100μl，混勻，于450nm 測(cè)定各孔吸光值（OD值），
參考值
實(shí)驗(yàn)正常的情況下，陽(yáng)性對(duì)照OD-陰性對(duì)照OD＞0.2。
檢驗(yàn)結(jié)果的解釋
1. S/P＝(樣本OD-陰性對(duì)照OD)/(陽(yáng)性對(duì)照OD-陰性對(duì)照OD)。
2. S/P≥0.4時(shí)結(jié)果判讀為陽(yáng)性。
3. 0.2＜S/P＜0.4時(shí)結(jié)果考慮可能存在抗體效價(jià)不足或疑似感染。
4. S/P＜0.2時(shí)結(jié)果判讀為陰性。
試驗(yàn)方法的局限性
1. 本試劑盒僅作為定性檢測(cè)羊血清、血漿中小反芻病毒抗體的粗略評(píng)估。
2. 本試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)需戴手套、穿工作衣，嚴(yán)格健全和執(zhí)行消毒隔離制度，各種實(shí)驗(yàn)廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
2.終止液具有腐蝕性，應(yīng)避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請(qǐng)立即用大量自來(lái)水沖洗。
3.酶標(biāo)板從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)恢復(fù)至室溫方可開(kāi)袋，未用完的酶標(biāo)板需放入有干燥劑的密封袋中保存。
4.濃縮洗滌液在低溫時(shí)容易結(jié)晶，使用時(shí)需恢復(fù)至室溫以溶解。
5.洗滌時(shí)各孔均需加滿(mǎn)液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。
6.用于檢測(cè)的樣品應(yīng)保持新鮮。
7.試驗(yàn)結(jié)果的判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
8.不同批號(hào)試劑組分不得混用。