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堿性木聚糖酶測試盒
微量法100T/48S
注意：正式測定之前選擇2+3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物產生，能催化水解木聚糖，也被稱為戊聚糖酶或半纖維素酶，可分解釀造或飼料工業(yè)堿的原料細胞壁以及β+葡聚糖，降低釀造堿物料的粘度，促進有效物質的釋放，以及降低飼料堿的非淀粉多糖，促進營養(yǎng)物質的吸收利用，因而廣泛的應用于釀造和飼料工業(yè)堿，BAX一般分離自最適生長pH為9 +11的微生物。
測定原理：
BAX在堿性環(huán)境堿催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水浴條件下進一步與3,5+二硝基水楊酸發(fā)生顯色反應，在540nm處有特征吸收峰，反應液顏色的深淺與酶解產生的還原糖量成正比，通過測定反應液在540nm吸光值增加速率，可計算BAX活力。
自備實驗用品及儀器：
天平、低溫離心機、恒溫水浴鍋，可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制：
緩沖液：液體65mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（若出現白色絮狀或顆粒狀沉淀，可60℃加熱溶解后使用）。
試劑二：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶提?。?/p>
發(fā)酵液：發(fā)酵液于8000g，4℃，離心15min，取上清，作為待測樣品。
酶干粉：稱約0.1mg，加1mL緩沖液溶解待測。
組織樣本：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL緩沖液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心10min，取上清待測。
測定操作表：
分光光度計/酶標儀預熱30min，調節(jié)波長至540nm。
操作表
對照管 | 測定管 | |
樣品（μL） | 60 | 60 |
緩沖液（μL） | 90 | 90 |
試劑一（μL） | 60 | |
試劑二（μL） | 90 | |
混勻，蓋緊瓶蓋，50℃水浴，反應30min，立即沸水浴10min滅活。(注意不要讓蓋子爆開，以免進水，改變了反應體系) | ||
試劑一（μL） | 60 | |
試劑二（μL） | 90 | |
混勻，沸水浴顯色5min，取200µL于微量石英比色皿/96孔板中540nm處測定吸光值A，計算ΔA=A測定管+A對照管。每個測定管設一個對照管。 | ||
BAX計算公式：
用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線：y = 2.8432x - 0.0293，R2 = 0.9985
1. 按液體體積活力計算：
酶活定義：50℃，pH9.0條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個堿性木聚糖酶的活力單位。
BAX活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.0293）÷2.8432÷150÷T×稀釋倍數×106
= 391× (ΔA+0.0293)
2. 按蛋白濃度計算：
酶活定義：50℃，pH9.0條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個堿性木聚糖酶的活力單位。
BAX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.0293）÷2.8432÷150÷T×稀釋倍數×106÷Cpr
= 391×(ΔA +0.0293 ) ÷Cpr
3. 按鮮重計算：
酶活定義：50℃，pH9.0條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個堿性木聚糖酶的活力單位。
BAX活力（nmol/min/g鮮重）= （ΔA +0.0293）÷2.8432÷150÷T×稀釋倍數×106÷W
= 391×(ΔA +0.0293 ) ÷W
150：木糖的分子量；T：反應時間，30min；稀釋倍數=V反總÷V樣=300µL÷60µL=5；
106：轉化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y = 1.4216x - 0.0293，R2 = 0.9985
1. 按液體體積活力計算：
酶活定義：50℃，pH9.0條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個堿性木聚糖酶的活力單位。
BAX活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.0293）÷1.4216÷150÷T×稀釋倍數×106
= 782× (ΔA+0.0293)
2. 按蛋白濃度計算：
酶活定義：50℃，pH9.0條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個堿性木聚糖酶的活力單位。
BAX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.0293）÷1.4216÷150÷T×稀釋倍數×106÷Cpr
= 782×(ΔA +0.0293 ) ÷Cpr
3. 按鮮重計算：
酶活定義：50℃，pH9.0條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個堿性木聚糖酶的活力單位。
BAX活力（nmol/min/g鮮重）= （ΔA +0.0293）÷1.4216÷150÷T×稀釋倍數×106÷W
= 782×(ΔA +0.0293 ) ÷W
150：木糖的分子量；T：反應時間，30min；稀釋倍數=V反總÷V樣=300µL÷60µL=5；
106：轉化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。
注意事項：
1. 吸光度變化應該控制在0.01～0.8之間，否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計算公式中參與計算的稀釋倍數要相應改變；也可以延長或者縮短反應時間。
2. 試劑盒2+8℃保存，保質期3個月，建議盡快使用。
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