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細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了致病性嗜水氣單胞菌的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于患病魚(yú)類(lèi)等易感動(dòng)物及水樣中致病性嗜水氣單胞菌的分離、鑒定，也可用于送檢菌株的鑒定。
2 致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)程序
2.1 嗜水氣單胞菌的分離
2.1.1準(zhǔn)備
2.1.1.1各種培養(yǎng)的制備方法見(jiàn)附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)。
2.1.1.2各種試劑的制備方法見(jiàn)附錄B(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)
2.1.2 待檢樣本
待檢樣本可包括病料、水樣及送檢菌株，病料既可是無(wú)菌采取的易感動(dòng)物的腎、肝、脾等未污染病料，也可是糞便或病變皮膚等污染病料，如樣本為菌株，應(yīng)先接種于普通肉湯28℃培養(yǎng)24h，再劃線接種于普通瓊脂平板，使之形成單個(gè)菌落，以供鑒定用。
2.3 分離
2.1.3.1未污染病料的分離
2.1.3.1.1接種環(huán)(鉑金耳)火焰滅菌，冷卻。
2.13.1.2 用接種環(huán)蘸取病料
2.1.31.3劃線接種于普通瓊脂平板。
2.1.3.1.4 28℃培養(yǎng)24h。
2.13.2 污染病料的分離
2.1.3.2.1接種環(huán)(鉑金耳)火焰滅菌，冷卻。
2.1.3.2.2用接種環(huán)蘸取病料。
2.1.3.2.3接種于RS瓊脂平板
2.1.3.2.4 28℃培養(yǎng)24h。
2.1.3.3 水樣的分離：
2.1.3.3.1用孔徑為0.2pm的硝酸纖維素微孔濾膜過(guò)濾水樣。
2.1.3.3.2取出濾膜，置含有滅菌堿性蛋白陳水的試管中。
2.1.3.3.3 28℃培養(yǎng)24h。
2.1.3.3.4劃線接種于普通瓊脂平板。
2.1.3.3.5 28℃培養(yǎng)24h。
2.2嗜水氣單胞菌的鑒定
2.2.1菌落形態(tài)
嗜水氣單胞菌在普通瓊脂平板上。電熱恒溫培養(yǎng)箱28-C培養(yǎng)24h后的菌落為光滑、微凸、圓整、無(wú)色或淡黃色，有特殊芳香氣味
2.2.2 氧化酶試驗(yàn)
2.2.2.1用鉑金耳挑取普通瓊脂平板上單個(gè)菌落少許。
2.2.2.2涂布于浸有1%鹽酸四甲基對(duì)苯胺的濾紙片上。
2.2.2.3 10s內(nèi)觀察細(xì)菌涂布處的顏色。
2.2.2.4 若細(xì)菌涂布處出現(xiàn)紅色，判為陽(yáng)性。
2.2.2.5嗜水氣單胞菌應(yīng)為陽(yáng)性。
2.2.3AHM鑒別培養(yǎng)
2.2.3.1用鉑金耳挑取普通瓊脂平板上氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性的單個(gè)菌落少許。
2.2-3.2 穿刺接種AHM鑒別培養(yǎng)基
2.2.3.3 37C培養(yǎng)24h。
2-2-3.4 嗜水氣單胞菌的表現(xiàn)為:頂部仍為紫色，底部為淡黃色;細(xì)菌沿穿刺線呈刷狀生長(zhǎng)，即運(yùn)動(dòng)力陽(yáng)性;部分菌株頂部呈黑色。
2.2.4 吲哚試驗(yàn)
2.2.4.1在長(zhǎng)有細(xì)菌的AHM鑒別培養(yǎng)基頂部，滴加3-4滴Kovacs試劑，
2.2-4.2若沿試管內(nèi)壁出現(xiàn)紅色環(huán)者，表明產(chǎn)生叫噪，判為陽(yáng)性。
2.2.4.3嗜水氣單胞菌應(yīng)為陽(yáng)性。
2.2.5 革蘭氏染色
2.2.5.1在一干凈載玻片上滴加一滴蒸餾水。
2.2.5.2用鉑金耳取AHM鑒別培養(yǎng)基表面菌落少許。
2.2-5,3在載玻片上與蒸餾水混合并均勻涂布。
2.2-5.4 自然干燥，火焰固定。
2.2.5.5加草酸錢(qián)結(jié)晶紫染液染1min-2min,
2.2-5.6 流水沖洗。
2.2.5.7加革蘭氏碘液作用1min-2min,
2.2-5.8流水沖洗。
2.2.5.9加復(fù)紅酒精染液染50s-60s,
2.2.5.10流水沖洗。
2.2.5.11干燥，鏡檢。
2.2.5.12 嗜水氣單胞菌應(yīng)為革蘭氏陰性短桿菌。
2.2.6 糖發(fā)酵試驗(yàn)
2.2.6.1用鉑金耳取AHM鑒別培養(yǎng)基表面菌落少許。
2.2-6.2分別接種葡萄糖、蔗糖、阿拉伯搪、七葉昔及水楊昔等5種糖發(fā)醉試驗(yàn)管。
2.2.6.3 電熱恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)24h,
2.2-6.4 凡試驗(yàn)管顏色從紫色變?yōu)辄S色，表明細(xì)菌可發(fā)酵該種糖類(lèi)，判為陽(yáng)性。
2.2.6.5嗜水氣單胞菌可發(fā)酵以上5種糖類(lèi)。
2.3嗜水氣單胞菌致病性鑒定
2.11脫脂奶平板試驗(yàn)
2.3.1.1用鉑金耳取AHM鑒別培養(yǎng)基表面菌落少許
2.3.1.2 接種劃線于1%脫脂奶蔗糖胰蛋白脈平板(見(jiàn)附錄A中A6)。
2.3.1.3 28℃培養(yǎng)24h,
2.3.1.4 若菌落周?chē)霈F(xiàn)清晰、透明的溶蛋白圈，判為陽(yáng)性
2.3.2 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)
2-3-2.1用鉑金耳取AHM鑒別培養(yǎng)基表面菌落少許。
2.3-2-2接種蔗糖胰蛋白陳肉湯，
2.3-2.328℃搖床(30r/min)培養(yǎng)48h。
2.12.4 10000r/min離心10min，取上清。
2.3.2.5用微量加樣器取5uL點(diǎn)樣于硝酸纖微素膜光面。
2.3.2.6 電熱恒溫培養(yǎng)箱37℃烘干。
2.3.2.7 N20%脫脂奶中，37℃封閉1h,
2.3.2.8用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗5次，每次2min
2.3.2.9置1：50兔抗嗜水氣單胞菌蛋白酶抗血清中，37℃作用1h。
2.3.2.10用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗5次，每次2min。
2.3.2.11置1：10酶標(biāo)羊抗兔抗血清中，37℃作用1h。
2.3.2.12 用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗5次，每次2min。
2.3.2.13加3,3一二氨基聯(lián)苯胺一過(guò)氧化氫中顯色。
2.3-2-14 待斑點(diǎn)明顯后，用去離子水終止顯色。
2.3-2-15 設(shè)無(wú)菌肉湯作陰性對(duì)照。
2.3.2.16 以出現(xiàn)明顯棕色斑點(diǎn)者判為陽(yáng)性。
3試驗(yàn)結(jié)果分析判定
符合以下特性者應(yīng)判為致病性嗜水氣單胞菌:
a)在普通瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)24h后的菌落為光滑、微凸、圓整、無(wú)色或淡黃色，有特殊芳香氣味;
b)在AHM鑒別培養(yǎng)基中，頂部仍為紫色，底部為淡黃色;細(xì)菌沿穿刺線呈刷狀生長(zhǎng)，即運(yùn)動(dòng)力陽(yáng)性;部分菌株頂部呈黑色;
c)氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，革蘭氏染色為陰性短桿菌;
d)叫噪試驗(yàn)陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉昔及水楊昔等5種糖類(lèi);
e)脫脂奶平板試驗(yàn)陽(yáng)性或斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)陽(yáng)性。
各種培養(yǎng)基的配制方法
Al普通肉湯
cas 3.0g
蛋白陳 10.0g
氯化鈉(NaCI) 5.0g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.0g
蒸餾水 1000mL
混勻，加熱溶解，調(diào)pH至7.6，分裝，112kPa高壓滅菌15min,
A2 普通瓊脂平板
cas 3.0g
蛋白陳 10.0g
氯化鈉(NaCI) 5.0g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 1000ml
混勻，加熱溶解，調(diào)pH至7.6，分裝,112kPa高壓滅菌15min，冷卻至45℃傾注滅菌平板。
A3 RS瓊脂平板
L-鹽酸鳥(niǎo)氨酸 6.5g
L-鹽酸賴氨酸 5.0g
L-鹽酸半朧氨酸 0.3g
麥芽糖 3.5g
硫代硫酸鈉(NaIS10·5H20) 6.8g
拘攤酸鐵胺 0.8g
脫氧膽酸鈉 1.0g
氯化鈉(NaCI) 5.0g
酵母提取物 3.0g
新生霉素 0.005g
澳察香草酚蘭 0.03g
瓊脂 13.5g
蒸餾水 1000ML
混合溶解，調(diào)PH至7.0,煮沸1min，冷卻至45C，傾注滅菌平板。
A4 堿性蛋白膝水
蛋白脈 10.0g
氯化鈉(NaCI) 8.5g
蒸餾水 1000ml
混勻，加熱溶解，調(diào)PH至9.0，分裝，112kPa高壓滅菌15mine
A5 AHM鑒別培養(yǎng)墓
蛋白膝 5.09
酵母提取物 3.09
胰蛋自陳 10.0g
L-鹽酸鳥(niǎo)氨酸 5.09
甘露醇 Log
肌醇 10.0g
硫代硫酸鈉(NaIS203·5H20) 0.4g
拘棣酸鐵胺 0.5g
澳甲酚紫 0.02g
瓊脂 3.0g
蒸餾水 1000mL
混勻，加熱溶解，調(diào)PH至6.7，分裝，112kPa高壓滅菌15min,
A6脫脂奶蔗箱胰蛋白膝平板
磷酸二氫鉀(KH2P04) 10.0g
(KCI） 1.5g
蔗糖 5.0g
胰蛋白陳 5.0g
脫脂奶粉 10.0g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 1000ml
混勻，加熱溶解，調(diào)PH至7.0，分裝，112kPa高壓滅菌15min，冷卻至45℃，傾注滅菌平板。
A7蔗精胰蛋白膝肉湯
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 10.08
(KCl) 1.5g
蔗糖 5.0g
胰蛋白陳 5.0g
脫脂奶粉 10.0g
蒸餾水 1000mL
餛勻，加熱溶解，調(diào)PH至7.0分裝，112kPa高壓滅菌15min 。
附 錄 B (標(biāo)準(zhǔn)的附錄)各種試劑配制方法
Bl Kovacs試荊
對(duì)二甲基氨基C11H14O2 5.0g
戊醇 75g
濃鹽酸 25mL
B2 草酸鐵結(jié)晶紫染液
甲液
結(jié)晶紫 2.0g
溶于95%乙醇20mL
乙液:
草酸銨 0.8g
溶于蒸餾水80mI。
使用前將甲液和乙液混合。
B3 革蘭氏碘液
碘(I） 1.0g
碘化鉀(KI） 2.0g
蒸餾水 100mL
B4 復(fù)紅酒精染液
堿性復(fù)紅 0.4g
95%乙醇 100mL
B5 箱發(fā)酵試驗(yàn)管
先配蛋白脈水(蛋白脈5.0g,蒸餾水1000mL，調(diào)pH至7.4，分裝，每瓶100mL).
每100mL蛋白脈水中分別加人葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉昔及水楊昔1.0g，充分溶解，分裝試管，106.44kPa高壓滅菌10min,
B 6 含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)
樣品：氯化鈉(NaCI) 8.0g
(KCl) 0.2g
磷酸氫二鈉(Na2HP0,) 1.44g
磷酸二氫鉀(KH,PO,) 0.24g
蒸餾水 800mI
調(diào)pH至7.4，加水定容至980mL;吐溫-80(Tween-80)20mL.
B7 3,3一二氮基聯(lián)苯胺一過(guò)妞化氮
先配二經(jīng)甲基氨基甲烷一鹽酸(Tris-HC1)緩沖液含(氯化鈉8.0g，KCl0.2g,Tris3.0g，蒸餾水800mL,調(diào)pH至7.4，加水定容至1000ml)。
Tris-HCI緩沖液 50ml
二氨基聯(lián)苯胺 250mg
臨用前取10ml,用蒸餾水10倍稀釋至100ml，加30%過(guò)氧化氫300ul。