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基于高光譜成像技術(shù)單壁碳納米管用于溶酶體脂質(zhì)通量的監(jiān)測
溶酶體是分解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類及其他物質(zhì)的細(xì)胞器，如果溶酶體分解機(jī)制發(fā)生“故障"，則導(dǎo)致底物（如脂質(zhì)和糖蛋白）在溶酶體腔內(nèi)積累，誘發(fā)溶酶體儲存障礙類疾?。↙SDs）。目前，因缺少對上述疾病的認(rèn)知，已開發(fā)的用于治療上述疾病的小分子還十分有限，且僅能測定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的含量。因此，開發(fā)出一種專門定位于溶酶體細(xì)胞器內(nèi)腔并及時對脂質(zhì)含量做出響應(yīng)的探針極其迫切。單壁碳納米管（SWCNTs）可以在近紅外（NIR）區(qū)域發(fā)出窄帶隙的高穩(wěn)定性熒光，這類熒光對局部擾動十分敏感，可以通過溶劑化顯色反應(yīng)對局部微環(huán)境變化做出響應(yīng)?；诖?，2017年，DanielA. Heller教授課題組在《ACSNano》上發(fā)表了題為“ACarbon Nanotube Optical Reporter Maps Endolysosomal Lipid Flux"的文章，報道了其在小分子探針領(lǐng)域的取得的研究成果。在該論文中作者們構(gòu)建了一種生物相容性良好的“光學(xué)報告器"，該報告器可以特異性定位在活細(xì)胞的溶酶體腔內(nèi)，而對細(xì)胞器的形態(tài)、消化底物的能力、細(xì)胞活力、增殖沒有影響。ss(GT)6-(8,6)對脂質(zhì)含量變化的響應(yīng)性作者們通過非共價鍵將SWCNTs與DNA結(jié)合在一起，采用高效液相色譜法（HPLC）對不同長度的SWCNTs進(jìn)行分離，并通過低密度的脂質(zhì)蛋白（LDL）誘導(dǎo)發(fā)射波長藍(lán)移，篩選出具有較大藍(lán)移位移的DNA-CNTs復(fù)合物，命名為ss(GT)6-(8,6)。借助于高光譜顯微鏡，獲得了在七種不同溶劑環(huán)境中ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物與溶劑介電常數(shù)的關(guān)系，證實(shí)了ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物與溶劑介電常數(shù)相關(guān)，分子動力學(xué)模擬也表明低介電常數(shù)會使ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物的發(fā)射波長藍(lán)移（圖1）。
圖1. ss(GT)6-(8,6)對脂質(zhì)的響應(yīng)；（a）標(biāo)準(zhǔn)化吸收-發(fā)射光譜；（b）發(fā)射波長與膽固醇-PEG濃度的函數(shù)；（c）不同溶劑中的平均發(fā)射波長；（d）分子動力學(xué)模擬平衡結(jié)構(gòu)示意圖；（e）水分子密度與SWCNTs表面距離的函數(shù)作者們使用熒光顯微鏡對ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物與哺乳動物細(xì)胞之間的相互作用進(jìn)行了探究。將巨噬細(xì)胞置于含0.2 mg/L ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物的10%血清(FBS)中培養(yǎng)，用新鮮的無復(fù)合物培養(yǎng)液沖洗，顯微鏡下巨噬細(xì)胞發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，說明ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物與細(xì)胞緊密結(jié)合在了一起，37℃之下培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度是4℃下的十倍，說明細(xì)胞對于ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物的內(nèi)吞作用有很強(qiáng)的能量依賴性。ss(GT)6-(8,6)在細(xì)胞內(nèi)的定位作者們對巨噬細(xì)胞進(jìn)行了一系列的成像實(shí)驗(yàn)確定了ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的位置。使用Cy3對DNA進(jìn)行標(biāo)記，分別在NIR和可見光區(qū)域?qū)NA-CNTs進(jìn)行成像，兩種情況下所觀察到的熒光信號在細(xì)胞內(nèi)的位置相同，說明結(jié)合到CNTs上DNA是定位CNTs的可靠指示劑。然后作者們用Lyso Tracker Green對Cy5標(biāo)記ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物進(jìn)行定位，結(jié)果表明Cy5和Lyso Tracker Green之間存在共域化，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.92 ± 0.036，曼德斯分裂共域系數(shù)為0.95 ± 0.018，說明CNTs的發(fā)射信號源在溶酶體內(nèi)腔，另外，CNTs的NIR發(fā)射源位置與Lyso Tracker Green發(fā)射源位置相同，這在一定程度上也支撐了上述結(jié)論。Au納米顆粒標(biāo)記CNTs的TEM圖也表明CNTs位于溶酶體腔內(nèi)（圖2- 4）。
圖2：Cy3標(biāo)記的ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物在NIR和可見光區(qū)域的熒光成像
圖3：Cy5標(biāo)記的ss(GT)6-(8,6)和Lyso Tracker Green在活細(xì)胞內(nèi)的熒光成像
圖4：ss(GT)6-(8,6)在細(xì)胞內(nèi)的定位；（a）Cy5標(biāo)記的ss(GT)6-(8,6)和Lyso Tracker Green在活細(xì)胞內(nèi)的熒光成像；（b）TMR-dextran和Alexa-647-SWCNT在U2OS-SRA cells中的共聚焦成像；（c）高斯擬合之后的TMR和Alexa 647的強(qiáng)度分布圖；（d）AuNP?SWCNT的TEM圖像；（e）AuNP?SWCNT在溶酶體腔內(nèi)的TEM圖像；（f）每個溶酶體細(xì)胞器內(nèi)AuNP?SWCNT相對頻率分布直方圖；（g）實(shí)驗(yàn)中測得的AuNP?SWCNT的頻率分布直方圖以及預(yù)測的游離AuNP頻率分布直方圖ss(GT)6-(8,6)的生物相容性為了評價ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的生物相容性。作者們首先利用0.2 mg/L的annexinV和PI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物不會影響細(xì)胞的存活和增值。TEM結(jié)果也表明ss(GT)6-(8,6)不會影響內(nèi)體性溶酶體細(xì)胞器的形態(tài)。更高濃度（1 nm/L）的ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物的含量也不會影響內(nèi)溶酶體細(xì)胞器的通透性。作者們?yōu)榱嗽u價ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物是否會影響內(nèi)溶酶體維持自身pH的能力，便采用特異性吸附到酸性小泡內(nèi)部的一種內(nèi)溶酶體熒光探針（LysoTracker）對細(xì)胞內(nèi)pH水平的變化進(jìn)行了評價，結(jié)果顯示，無論是添加或不添加ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物，LysoTracker的熒光強(qiáng)度均無顯著差異。作者們還探究了添加DNA-CNTs對溶酶體水解脂類蛋白的影響，作用1 mg/L的Alexa-SWCNTs處理U2OS-SRA細(xì)胞，并在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加50 μg/mL的Alexa 488-AcLDL以誘導(dǎo)細(xì)胞吸收脂類蛋白。研究表明，添加或不添加DNA-CNTs的細(xì)胞在脂類分解水平上沒有差異。此外，脂質(zhì)生化分析也表明，包含CNTs的細(xì)胞與不含CNTs的細(xì)胞的膽固醇和總脂質(zhì)含量均無明顯差異，脂毒素成像與低密度脂蛋白受體的表達(dá)也表明ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物不會影響細(xì)胞器對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的處理（圖5）。
圖5：ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物對溶酶體功能的影響；（a）在U2OS-SRA細(xì)胞中LysoTracker-Red (綠)，Alexa 647-SWCNT(紅)和合并圖的共聚焦熒光成像；（b）沿合并圖像中虛線分布的兩個熒光圖熒光強(qiáng)度；（c）包含Alexa 647-SWCNT和不包含Alexa 647-SWCNT的輻射強(qiáng)度；（d）包含Alexa 488-AcLDL和不包含Alexa 488-AcLDL的U2OS-SRA細(xì)胞熒光成像；（e）感興趣區(qū)域的Alexa 488-AcLDL數(shù)量高光譜顯微鏡監(jiān)測溶酶體內(nèi)腔脂質(zhì)含量的變化為了測定脂質(zhì)在溶酶體細(xì)胞內(nèi)的積聚，作者先用U18666A或Lalistat 3a2對RAW 264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，后與ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物在37oC下培養(yǎng)，以未經(jīng)預(yù)處理的巨噬細(xì)胞作為空白對照。采用高光譜顯微鏡對上述三種細(xì)胞進(jìn)行成像，與對照組相比，兩種經(jīng)預(yù)處理之后的細(xì)胞發(fā)生了藍(lán)移，兩種細(xì)胞中都含有ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物。核內(nèi)質(zhì)溶酶體脂質(zhì)圖譜反映了ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物對核內(nèi)溶酶體腔內(nèi)脂質(zhì)積聚的光學(xué)響應(yīng)，作者建立了一個關(guān)于CNTs發(fā)射峰值與脂質(zhì)濃度之間的關(guān)系，對于U18666A處理過的細(xì)胞而言，NCP1蛋白的表達(dá)受到了阻礙，游離的膽固醇開始在溶酶體內(nèi)腔積累，從而使得游離的膽固醇附著在ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物的表面，導(dǎo)致CNTs發(fā)射峰藍(lán)移。同樣地，對于Lalistat 3a2處理過的細(xì)胞而言，更多游離的膽固醇脂附著在CNTs的表面，導(dǎo)致CNTs的發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移。因此，作者發(fā)現(xiàn)通過溶劑化變色作用，ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物可以作為內(nèi)溶酶體脂質(zhì)含量變化的指示器（圖6）。
圖6：活細(xì)胞內(nèi)溶酶體脂質(zhì)積累的監(jiān)測；（a）ss(GT)6-(8，6)復(fù)合物在U18666A或Lalistat 3a2預(yù)處理過的巨噬細(xì)胞示意圖；（b）RAW 264.7巨噬細(xì)胞的高光譜圖像NCP1型成纖維細(xì)胞的脂質(zhì)含量的測定及單細(xì)胞細(xì)胞器內(nèi)脂質(zhì)含量的量化作者評估了ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物在NPC1型溶酶體脂質(zhì)儲存障礙型疾病患者原代纖維細(xì)胞中的脂質(zhì)積累變化的響應(yīng)，高光譜數(shù)據(jù)表明，ss(GT)6-(8,6)在NPC1成纖維細(xì)胞中平均藍(lán)移6 nm，野生型成纖維細(xì)胞內(nèi)溶酶體細(xì)胞器的脂質(zhì)含量比較均勻，而NPC1細(xì)胞內(nèi)的輻射分布較廣。為了測試ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物的可逆性，作者用羥丙基β-環(huán)糊精對NPC1細(xì)胞進(jìn)行處理，處理之后的高光譜圖像表明，來自先前藍(lán)移的NPC1細(xì)胞的報告基因發(fā)生了顯著的紅移。作者們還對該復(fù)合物進(jìn)行了單細(xì)胞動力學(xué)測試，使用ACLDL和U18666A對細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)積累誘導(dǎo)，并使用高光譜圖像檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的變化，研究表明，單個細(xì)胞的平均發(fā)射波長均發(fā)生藍(lán)移，并在90min達(dá)到平衡，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的時間常數(shù)平均約為40min，呈對數(shù)正態(tài)分布。在證明了ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物可以在單細(xì)胞水平上可以監(jiān)測脂質(zhì)的積累后，作者們還對該ss(GT)6-(8,6)復(fù)合物在細(xì)胞器水平上定量監(jiān)測脂質(zhì)積累的能力進(jìn)行了研究，采用高光譜圖像技術(shù)對骨髓來源的單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，溶酶體內(nèi)單個細(xì)胞器脂質(zhì)含量變化的差異性進(jìn)行了監(jiān)測（圖7）。
圖7：定量測定單核細(xì)胞內(nèi)溶酶體細(xì)胞器內(nèi)脂質(zhì)的差異性；（a）近紅外高光譜的寬場疊加圖像；（b）兩種細(xì)胞的內(nèi)溶酶體脂質(zhì)高光譜圖像；（c）ss（GT）6-(8，6)復(fù)合物在兩種細(xì)胞的發(fā)射像素點(diǎn)內(nèi)的頻率分布直方圖概而論之，本工作作者們構(gòu)建了一種溶酶體脂質(zhì)通量變化的“光學(xué)報告器"，該“光學(xué)報告器"可以準(zhǔn)確的定位在細(xì)胞的溶酶體內(nèi)腔，而對細(xì)胞的正常生理過程沒有影響，借助于高光譜顯微鏡，可以繪制出細(xì)胞及細(xì)胞器內(nèi)脂質(zhì)含量的圖像。本工作作為shouci報道測量細(xì)胞內(nèi)溶酶體脂質(zhì)通量的文章，有望在未來脂質(zhì)類藥物的篩選和脂質(zhì)相關(guān)疾病的探索研究中發(fā)揮重大作用。
參考文獻(xiàn)
[1] Jena P V, Roxbury D, Galassi T V, etal. A carbon nanotube optical reporter maps endolysosomal lipid flux[J]. ACSNano, 2017 11(11) 10689-10703.