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血管造影OCT能夠區(qū)分小鼠皮下表達(dá)不同VEGF亞基的纖維肉瘤的血管模式
小鼠皮下植入腫瘤模型常用于癌癥研究，盡管腫瘤植入的位置很淺，但對(duì)于微血管研究來(lái)說(shuō)，以足夠的空間分辨率進(jìn)行無(wú)創(chuàng)成像仍然是一個(gè)難題。英國(guó)謝菲爾德大學(xué)的研究人員Robert A. Byers等評(píng)估了使用OCT血管造影術(shù)直接對(duì)這種小鼠模型中腫瘤血管成像的能力。使用的腫瘤來(lái)源于纖維肉瘤細(xì)胞，經(jīng)基因工程改造后僅表達(dá)VEGF120或VEGF188（分別為fs120和fs188腫瘤）。研究發(fā)現(xiàn)fs120腫瘤的血管直徑（60.7 ± 4.9 μm）顯著大于fs188腫瘤（45.0 ± 4.0 μm）。fs120腫瘤還顯示出明顯更高的血管彎曲度、分形維數(shù)和密度。為觀察皮下腫瘤微循環(huán)的縱向動(dòng)力學(xué)提供了一種可靠、無(wú)創(chuàng)的方法。研究成果以“Vascular patterning of subcutaneous mouse fibrosarcomas expressingindividual VEGF isoforms can be differentiated using angiographic opticalcoherence tomography"為題發(fā)表于Biomedical Optics EXPRESS。
背景
生物體中，主要?jiǎng)用}和靜脈的結(jié)構(gòu)特征受遺傳控制，通常在個(gè)體間保持一致。然而微血管系統(tǒng)則會(huì)受到局部微環(huán)境中分子和機(jī)械刺激而發(fā)生動(dòng)態(tài)重塑。腫瘤的生長(zhǎng)依賴于持續(xù)的微血管化過(guò)程，特別是通過(guò)血管生成，這也促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移，由此產(chǎn)生的腫瘤脈管系統(tǒng)在形態(tài)和功能上都是異常的，研究腫瘤的脈管系統(tǒng)可能為腫瘤的發(fā)展和病理生理學(xué)提供很有價(jià)值的信息。
利用小鼠癌癥模型進(jìn)行的血管造影成像研究在腫瘤學(xué)研究中特別重要，能大大有助于我們了解腫瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展和活體動(dòng)物的治療。而傳統(tǒng)的尸檢方法如免疫組織化學(xué)，仍在量化植入腫瘤內(nèi)的微循環(huán)中占重要地位。非侵入性成像技術(shù)由于縱向血管可視化的潛力很快獲得了發(fā)展，大大減少了產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)可靠數(shù)據(jù)所需的動(dòng)物數(shù)量。目前，活體顯微技術(shù)被廣泛用于研究腫瘤生長(zhǎng)，通常包括用透明玻璃蓋玻片對(duì)高度散射的皮膚層進(jìn)行手術(shù)置換。使用該模型，血管造影OCT成像已被用于實(shí)現(xiàn)腫瘤動(dòng)力學(xué)和治療反應(yīng)的高分辨率縱向成像。此外，通過(guò)灌注計(jì)算機(jī)斷層掃描和動(dòng)態(tài)磁共振成像，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)皮下生長(zhǎng)腫瘤的體內(nèi)全視野血管造影，同時(shí)覆蓋的皮膚完好無(wú)損。最近，多光譜光聲斷層掃描已被用于可視化1 cm3腫瘤體積中的血管形態(tài)和氧合，分辨率達(dá)70 μm。
盡管取得了這些進(jìn)展，但對(duì)皮下植入腫瘤內(nèi)的微循環(huán)（通常直徑為5-50 μm）進(jìn)行非侵入性成像仍然具有難度，因?yàn)槌上袼玫墓鈱W(xué)模式通常無(wú)法穿透皮膚的高度散射層。OCT已被廣泛用于捕捉人體皮膚內(nèi)的結(jié)構(gòu)和血管造影圖像。zuizhide注意的是，OCT在組織內(nèi)的穿透深度可達(dá)約1 mm，并能夠提取深度編碼數(shù)據(jù)，從而可以以高分辨率可視化組織的各個(gè)層。相比于幾毫米厚的人皮膚，雌性CD-1裸鼠淺表組織通常約550 μm厚（~30 μm表皮，~220 μm真皮，~300 μm皮下），因此皮下植入腫瘤的表面脈管系統(tǒng)是可見(jiàn)的，并且在OCT的視野內(nèi)。散斑方差OCT（svOCT）可用于從四維OCT數(shù)據(jù)集（X-Y-Z-Time）中提取流動(dòng)信息，在每個(gè)空間位置收集多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。這是基于這樣一個(gè)事實(shí)，即與固體組織像素相比，流體像素將在OCT信號(hào)（散斑模式）中顯示快速演變的時(shí)間變化。因此，通過(guò)計(jì)算同一空間位置像素的方差作為時(shí)間的函數(shù)，在靜止固體和運(yùn)動(dòng)液體之間產(chǎn)生對(duì)比度。
本研究旨在開(kāi)發(fā)和評(píng)估血管造影svOCT在小鼠皮下腫瘤成像中的應(yīng)用及性能。試圖區(qū)分小鼠腫瘤內(nèi)的血管形態(tài)，這些腫瘤來(lái)源于基因工程化的纖維肉瘤細(xì)胞，僅表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的單一剪接變異體亞型；VEGF120或VEGF188（分別為fs120和fs188腫瘤）。以前，使用在植入小鼠背部的透明小室中生長(zhǎng)的腫瘤和常規(guī)活體光學(xué)顯微鏡，我們觀察到與fs188腫瘤相比，fs120腫瘤血管更大、更雜亂，并形成更曲折的血管網(wǎng)絡(luò)。這項(xiàng)研究旨在確定這些不同的血管模式在皮下生長(zhǎng)腫瘤的微循環(huán)中是否也存在，是否存在普遍性，并不僅限于褶皺窗室模型中。
圖1. 實(shí)驗(yàn)裝置。A）用于異氟醚氣體麻醉給藥的嚙齒類動(dòng)物面罩。B） CD-1裸鼠。C）塑料支架，輕輕接觸皮下腫瘤周圍的皮膚。D）OCT成像探頭（Vivosight）。E）反饋控制的加熱墊。F）直腸溫度探頭（反饋至加熱墊）。G）用于OCT成像探頭重新定位的移動(dòng)夾具。
結(jié)果
01-表達(dá)VEGF120和188的腫瘤的目視檢查
圖4為CD1裸鼠對(duì)照皮膚和皮下植入腫瘤皮膚的en-face svOCT圖像，帶有深度編碼信息。使用svOCT時(shí)大的異常血管網(wǎng)在只能在植入后約8-15天可見(jiàn)（圖4E-L），在此之前可見(jiàn)的是更規(guī)則的有組織的血管網(wǎng)絡(luò)（圖4A-D）。表明腫瘤血管發(fā)育的早期階段，血管處在組織更深層，無(wú)法通過(guò)OCT成像。然而腫瘤充分?jǐn)U張后，通常在植入后約10天，OCT系統(tǒng)視野內(nèi)可以清楚地看到大的異常血管。后期掃描中除了較大的異常血管外，0-400 μm處的血管造影信號(hào)相對(duì)較低，意味著似乎沒(méi)有觀察到類似基線脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，表明隨著皮膚在腫瘤表面上伸展，正常血管中的血流停止。此外，fs120腫瘤似乎比f(wàn)s188更具浸潤(rùn)性，血管大部分呈紅色（0-400 μm深度），而fs188大部分血管呈綠色（400-800 μm）。這可能與細(xì)胞的*表型有關(guān)，無(wú)論是體外或體內(nèi)研究中，fs120細(xì)胞都比f(wàn)s188表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖表型。本研究中svOCT技術(shù)有一個(gè)局限性，在檢測(cè)到的血管下觀察到陰影效應(yīng)，這是由血液對(duì)光子的前向散射引起的,會(huì)遮擋下面的脈管系統(tǒng)。就fs120腫瘤而言，許多可能位于400-800 μm深度（綠色）的血管被0-400 μm深度（紅色）的淺表血管遮擋住了，這使得在同等深度進(jìn)行血管密度計(jì)算具有一定難度。
圖4. en-face svOCT圖像。A-D）無(wú)腫瘤的基線鼠皮膚脈管系統(tǒng)。E-L）已建立的皮下腫瘤脈管系統(tǒng)。E-H）fs120腫瘤。I-L）fs188腫瘤。所有圖像都是從不同的動(dòng)物身上拍攝的。顏色對(duì)應(yīng)被檢測(cè)血管的深度，紅色在皮膚表面下0-400 μm，綠色在皮膚表面下400-800 μm。
02-縱向腫瘤監(jiān)測(cè)的評(píng)估
無(wú)創(chuàng)皮下腫瘤成像的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是能對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和血管發(fā)育進(jìn)行縱向觀察。圖5為縱向數(shù)據(jù)采集舉例，在5天的時(shí)間內(nèi)分別采集同一個(gè)fs120和fs188腫瘤的圖像。對(duì)fs188腫瘤內(nèi)血管發(fā)育進(jìn)行了從第0天到第15天的長(zhǎng)時(shí)間可視化。
圖5 頂行和中間行為5天內(nèi)對(duì)fs120和fs188腫瘤的svOCT短期監(jiān)測(cè)圖。圖像經(jīng)UnwarpJ 彈性配準(zhǔn)過(guò)，使得相同的血管在后續(xù)frame中對(duì)齊。底行為從腫瘤植入前到腫瘤植入后15天對(duì)fs188腫瘤的長(zhǎng)期縱向血管進(jìn)展監(jiān)測(cè)圖。
fs120腫瘤中，每平方毫米的平均血管長(zhǎng)度在植入后第14天達(dá)到最高（4.1 mm-1），然后第15天降至1.4 mm-1，第17天恢復(fù)至3.5 mm-1，隨后第18天再次降至2.1 mm-1。相比之下fs188腫瘤中，平均血管長(zhǎng)度從第14天的1.1 mm-1增加到第15天的2.2 mm-1，第17天減少到2.0 mm-1，隨后第18天恢復(fù)到2.2 mm-1。計(jì)算植入后14至18天內(nèi)，兩組腫瘤中每平方毫米平均血管長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)差，用t檢驗(yàn)評(píng)估顯著性。除去不合適的數(shù)據(jù)，最終可行數(shù)據(jù)集的數(shù)量n = 4。雖然與fs188組（SD = 0.4 mm-1）相比，fs120組的血管長(zhǎng)度隨時(shí)間的變化更大（SD = 1.4 mm-1），但由于樣本數(shù)量少，該結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著（p = 0.063）。因此尚不能確定fs120腫瘤平均血管長(zhǎng)度是否確實(shí)是每天變化較大。圖6為每只動(dòng)物每平方毫米平均血管長(zhǎng)度隨時(shí)間的變化。
圖6 皮下腫瘤內(nèi)每平方毫米血管長(zhǎng)度隨時(shí)間變化的線圖，藍(lán)色為fs120，紅色為fs188。
血管數(shù)量每天的變化不太可能是血管重塑造成的，可能是塑料支撐帽對(duì)皮膚產(chǎn)生的壓力，或者血管連接內(nèi)的局部血流減少到OCT系統(tǒng)的幀采集間隔（~ 30ms）以下，血流信號(hào)喪失。此外當(dāng)該區(qū)域?qū)囟鹊韧獠看碳さ奈⑿∽兓龀龇€(wěn)態(tài)反應(yīng)時(shí)，也可能會(huì)引發(fā)血管收縮或上游血管分流導(dǎo)致血管不可見(jiàn)。本研究使用的異氟醚麻醉劑也很可能既影響體溫調(diào)節(jié)抑制的程度，又作為心血管抑制劑，降低血壓。
03-OCT深度穿透評(píng)估
圖7為從CD1裸鼠背部采集的OCT B-scan與組織學(xué)樣本的比較。健康皮膚（圖7A，B）中，厚厚的皮下層（約400 μm）填充有密集的毛囊，毛囊會(huì)散射入射的1300 nm OCT光束，阻止光穿透到組織深處。OCT圖像的右側(cè)可以看到一部分薄薄的橫紋肌層，但這層下的結(jié)構(gòu)看不到。
圖7. 比較OCT與組織切片的穿透深度。A）健康皮膚的H&E染色切片。B）健康皮膚的OCT（與A的動(dòng)物不同）。C）fs120腫瘤上方皮膚的H&E染色切片，顯示缺乏肌肉層。D）fs120腫瘤上方皮膚的OCT B-scan（與C同一只動(dòng)物）。E）fs188腫瘤上方皮膚的H&E染色切片，可見(jiàn)肌肉層下方的fs188腫瘤。F）fs188腫瘤上方皮膚的OCT B-scan（與E同一只動(dòng)物）。
已知鼠皮膚內(nèi)皮下組織的厚度受毛發(fā)周期調(diào)節(jié)，但腫瘤的存在明顯改變了外部皮膚形態(tài)（圖7C，E）?？紤]到皮下組織在橫截面OCT圖像上的對(duì)比度變化，選擇組織切片進(jìn)行皮下組織厚度的測(cè)量研究。使用MATLAB手動(dòng)跟蹤皮下組織的上層和下層，然后結(jié)合上下層邊界之間的垂直距離來(lái)計(jì)算皮下組織厚度的平均值。對(duì)比健康皮膚（n = 7）與研究結(jié)束時(shí)fs188和fs120腫瘤（每組n = 7）周圍皮膚中的皮下組織厚度，在三組間進(jìn)行單因素方差分析，HSD檢驗(yàn)以評(píng)估顯著性，結(jié)果總結(jié)在圖8中。
圖8. 健康皮膚的皮下組織層厚度變化，與包裹著直徑約12 mm的fs188和fs120腫瘤的皮膚皮下組織層厚度變化的比較。
健康皮膚的皮下組織（357 ± 94 μm）明顯比f(wàn)s188組（182 ± 62 μm，p<0.01）和fs120組（57 ± 60 μm，p<0.001）的皮下組織厚。fs188和fs120組中皮膚的厚度顯著減少（p = 0.015）可能是由皮膚在生長(zhǎng)的腫瘤上伸展時(shí)受到異常應(yīng)力引起的。fs188腫瘤中可觀察到皮下組織變?。▓D7E，F(xiàn)），OCT能夠捕獲皮膚的上層（表皮、真皮）、脂肪層（皮下組織）、肌肉層及腫瘤內(nèi)約500 μm深處，總穿透深度約1 mm。在fs120腫瘤組中，大多數(shù)皮膚形態(tài)比較特殊，因?yàn)槿狈M紋肌層，在一些jiduan情況下皮下組織也受到嚴(yán)重破壞，脂肪細(xì)胞分散在腫瘤內(nèi)，皮下組織中也明顯缺乏毛囊（圖7C），再次證明fs120腫瘤可能更具侵襲性。在fs120這種情況下，淺表皮膚的剩余層厚約200 μm，僅由表皮、真皮和極薄的皮下組織構(gòu)成，因此OCT能觀察腫瘤組織更深處（圖7D），這可能解釋了為什么在小于300 μm的表面深度處可以看到大的異常腫瘤脈管系統(tǒng)（圖4）。
圖9為健康、fs120和fs188皮膚的H&E和CD31染色切片之間的比較。健康皮膚中（圖9A、D、G），CD31免疫染色顯示小鼠皮膚的整個(gè)真皮、皮下組織和橫紋肌層中存在血管內(nèi)皮細(xì)胞。紅色箭頭所示為最大的可見(jiàn)血管腔，直徑約15 μm。在含fs120腫瘤的皮膚中（圖9B、E、H），腫瘤周邊大部分血管都可見(jiàn)，最大的直徑約65 μm（紅色箭頭）。在含fs188腫瘤的皮膚中（圖9C、F、I），真皮/皮下組織內(nèi)仍有血管形成的證據(jù)，但是大多數(shù)可見(jiàn)血管位于腫瘤內(nèi)部，位于深度約為600 μm的橫紋肌層正下方，最大直徑約50 μm（紅色箭頭）。
圖9. A-C）健康、fs120和fs188皮膚的H&E染色切片。D-F）健康、fs120和fs188皮膚的CD31免疫染色切片。內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕色。紅色箭頭為最大的可見(jiàn)血管腔。G-I）紅色方框中的放大圖。此處的fs120腫瘤是植入后14天切除的，與圖9中的腫瘤不同；fs188腫瘤是在植入后20天切除的，與圖9中的為同一個(gè)腫瘤。
一般來(lái)說(shuō)，該系統(tǒng)的穿透深度足以捕獲fs120和fs188腫瘤內(nèi)的淺層脈管系統(tǒng)，但在某些特定位置，軸向深度穿透仍取決于上皮層中是否存在高散射結(jié)構(gòu)。圖7B、D、F中可見(jiàn)表面散射結(jié)構(gòu)（如毛囊）的帶狀陰影，這些陰影可能會(huì)遮擋正下方血管的血管造影信號(hào)。
04-定量血管度量
血管造影圖像二值化產(chǎn)生血管骨架，從而定量血管參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，fs120腫瘤（60.7 ± 4.9 μm）的平均血管直徑明顯高于fs188腫瘤（45.0 ± 4.0 μm），與之前使用窗室模型的活體觀察研究結(jié)果一致。Vakoc等人已經(jīng)證明了窗室模型成像的背景下對(duì)于大血管，多光子顯微術(shù)和OCT血管造影之間具有良好相關(guān)性，但對(duì)直徑小于12 μm的毛細(xì)管相關(guān)性較差?？紤]到fs188腫瘤血管形態(tài)較薄，對(duì)fs188平均血管直徑測(cè)量的影響可能比對(duì)fs120更大，但不同腫瘤類型之間的差異仍然顯著。
圖10. fs120腫瘤（n = 9）和fs188腫瘤（n = 8）間定量血管參數(shù)的變化。
fs120腫瘤每平方毫米的總血管長(zhǎng)度（4.3 ± 1.5 mm-1）明顯大于fs188（2.2 ± 0.7 mm-1），fs120腫瘤的總血管密度（31.7 ± 11.1%）也比f(wàn)s188腫瘤（14.8 ± 5.0%）高，與之前研究得到的密度計(jì)算值一致。而之前的窗室模型中得到的結(jié)果與此相反，fs120腫瘤每平方毫米總血管長(zhǎng)度較低。這很可能是不同深度或量化方法造成的。事實(shí)上由于fs188腫瘤浸潤(rùn)性較弱，脈管系統(tǒng)處于較表層皮膚中，而本所用文骨架化是在0-800 μm的大深度范圍內(nèi)進(jìn)行的，這將直接導(dǎo)致檢測(cè)到的整個(gè)fs188脈管系統(tǒng)的長(zhǎng)度減少。但相同組織深度直接比較，fs120中深處血管又會(huì)被淺表血管的陰影所遮擋，產(chǎn)生不準(zhǔn)確結(jié)果。因此本研究只考慮qian100 μm的可見(jiàn)脈管系統(tǒng)，將脈管系統(tǒng)與組織深度分離，得出的fs120腫瘤每平方毫米血管長(zhǎng)度（1.5 ± 0.7 mm-1）顯著低于（p = 0.04）fs188腫瘤（2.2 ± 0.3 mm-1）。仍不能確認(rèn)諸如總血管長(zhǎng)度/密度之類的深度相關(guān)度量是否可靠。
不同腫瘤類型之間平均血管段長(zhǎng)度沒(méi)有顯著差異，與之前的窗室模型觀察結(jié)果一致。fs120組中的血管網(wǎng)絡(luò)的平均彎曲度和分形維數(shù)（分別為1.56 ± 0.29和1.33 ± 0.17）都顯著高于fs188組（分別為1.33 ± 0.13和0.98 ± 0.18）。考慮到不同腫瘤類型之間的平均血管段長(zhǎng)度沒(méi)有差異，fs120腫瘤中彎曲度較高意味著fs120血管網(wǎng)絡(luò)的分支點(diǎn)比f(wàn)s188腫瘤的分支點(diǎn)靠得更近，而不是分支點(diǎn)之間的血管本身更彎曲。這反映在分形維數(shù)測(cè)量中，fs188s的分形維數(shù)較低，表明血管網(wǎng)絡(luò)更規(guī)則、更有組織。這也與之前用活體顯微鏡對(duì)這些腫瘤類型的觀察相一致，即fs120血管通常較寬且排列非?；靵y，而fs188血管規(guī)則排列且均勻狹窄。
總結(jié)
本文使用OCT系統(tǒng)成功地非侵入性地量化了皮下植入的表達(dá)不同血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子亞型的小鼠腫瘤的淺表脈管系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)差異，獲得的結(jié)果與先前研究中常規(guī)方法結(jié)果一致。證明使用OCT無(wú)需手術(shù)干預(yù)即可測(cè)得腫瘤血管的已知形態(tài)學(xué)差異，不但允許對(duì)腫瘤進(jìn)行三維環(huán)境中的生長(zhǎng)和觀察，還可實(shí)現(xiàn)縱向監(jiān)測(cè)。為腫瘤研究提供了新思路，也為臨床治療護(hù)理提供了非常有價(jià)值的工具。
參考文獻(xiàn)：Robert, et al. "Vascular patterning of subcutaneous mouse fibrosarcomas expressing individual VEGF isoforms can be differentiated using angiographic optical coherence tomography." Biomedical Optics Express (2017).