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固有柔腦膜側(cè)支化對缺血性卒中后快速血流募集的影響
柔腦膜側(cè)支狀態(tài)可獨(dú)立預(yù)測卒中結(jié)果。美國和日本研究人員Atsushi Kanoke等使用光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)，通過比較固有軟腦膜側(cè)支化程度不同的兩種品系小鼠，確定了缺血性卒中后側(cè)支流動(dòng)和下游血液動(dòng)力學(xué)的時(shí)空動(dòng)態(tài)。發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠大腦中動(dòng)脈（MCA）閉塞后，立即檢測到柔腦膜側(cè)支血流的強(qiáng)勁補(bǔ)充，并在7天內(nèi)持續(xù)。而Balb/C小鼠在MCA閉塞期間和之后一天，都幾乎沒有觀察到側(cè)支血流募集，雖然閉塞后7天皮質(zhì)灌注略有提高，但還是造成了更大的梗塞面積和更差的卒中結(jié)果。兩品系小鼠在MCA閉塞后30min內(nèi)，穿透性小動(dòng)脈（PA）的血流量都減少了90%以上，其中Balb/C小鼠的血流量減少更顯著，恢復(fù)更少。此外，與Balb/C小鼠MCAO閉塞后，毛細(xì)血管通過時(shí)間的不均勻性也較C57BL/6小鼠延長更多。表明皮質(zhì)卒中后，固有柔腦膜側(cè)支的范圍會(huì)影響下游的血液動(dòng)力學(xué)，并對微血管床產(chǎn)生長期影響。研究成果以“The impact of native leptomeningeal collateralization on rapid blood flowrecruitment following ischemic stroke"為題發(fā)表于Journalof Cerebral Blood Flow & Metabolism。
背景
威利斯環(huán)（CW）和柔腦膜（LMA）血管網(wǎng)分別包含初級和次級側(cè)支通路。其中LMA側(cè)支可能涉及向大腦皮層表面提供雙向動(dòng)脈血液、連接大腦前動(dòng)脈（ACA）和大腦中動(dòng)脈（MCA）、大腦中動(dòng)脈（MCA）和大腦后動(dòng)脈（PCA），并在較小程度上連接ACA和PCA。當(dāng)CW下游的大腦動(dòng)脈突然閉塞時(shí)，需要招募以上血管招募來維持血液供應(yīng)。大量證據(jù)表明缺血性卒中后的LMA側(cè)支化可作為卒中結(jié)果的有力預(yù)測指標(biāo)。因此在急性缺血性卒中患者治療管理中，通過神經(jīng)成像技術(shù)評定側(cè)支流動(dòng)狀態(tài)已成為一項(xiàng)可靠的決策評估，且已經(jīng)ESCAPE臨床驗(yàn)證。已知年齡、血管風(fēng)險(xiǎn)和遺傳因素都能影響側(cè)支的發(fā)育及動(dòng)態(tài)應(yīng)答，但對于影響腦血管側(cè)支化的因素并不*明了。
通過比較近交品系小鼠，對影響固有LMA側(cè)支程度的遺傳因素已經(jīng)有了很好的研究，并已用于預(yù)測MCA卒中后的梗死體積。同源圖譜確定該遺傳變異為Dce1。Dce1等位基因滲入Balb/ C基因組可使野生型Balb/C小鼠軟腦膜側(cè)支恢復(fù)83%，并在大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）后以等位基因依賴的方式恢復(fù)腦血流、減少梗塞體積，證實(shí)了固有側(cè)支對缺血區(qū)腦血流灌注的重要性。
盡管一直固有側(cè)支循環(huán)與急性缺血性卒中后腦損傷的嚴(yán)重程度間存在既定聯(lián)系，但尚不清楚LMA側(cè)支系統(tǒng)補(bǔ)償腦血流的時(shí)間模式，以及它如何影響缺血性卒中后下游較小血管的血液供應(yīng)。由于沒有適當(dāng)?shù)姆椒?，許多臨床前研究無法評估滋養(yǎng)動(dòng)脈對缺血區(qū)域的貢獻(xiàn)，只能依賴于評估整體血液灌注或yiti檢查。本研究假設(shè)LMA側(cè)支程度減小、先前存在的LMA側(cè)支直徑減小會(huì)影響卒中后血液從軟腦膜血管灌注到微血管床，使用光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)（OCTA）評估皮質(zhì)的腦血流動(dòng)力學(xué)（圖1）。使用固有LMA側(cè)支發(fā)育程度不同的兩種小鼠品系C57BL/6和Balb/C，確定了缺血性卒中后LMA吻合周圍的空間和時(shí)間動(dòng)力學(xué)。還描述比較了不同側(cè)支血流對下游穿透小動(dòng)脈和毛細(xì)血管中血流的影響，以及不同側(cè)支血流對卒中結(jié)果的影響。
圖1 OCT系統(tǒng)和OMAG方法示意圖。（a）1310 nm SD-OCT系統(tǒng)設(shè)置示意圖。（b）OMAG掃描方案。一個(gè)cluster執(zhí)行八次重復(fù)掃描，OMAG算法提取血流信息。400幀形成一個(gè)OMAG體積。（c）3D OMAG體積的正面MIP。（d）使用DOMAG算法獲得的速度B幀。（e）雙向軸向速度圖。彩色條表示從大腦下行（負(fù)，綠色）和上行（正，紅色）血流的紅細(xì)胞軸向速度，在±6.1mm/s范圍內(nèi)。（f）大腦皮層中下行的PA血流（頂部）和上行的小靜脈血流（底部）。（g）X-Y平面矩形切片（頂部）和帶有穿過平面的PA和小靜脈血流信號的矩形切片（底部）。
圖2 OCT毛細(xì)血管測速法示意圖。（a）OCTA測速掃描協(xié)議示意圖。（b）掩模對毛細(xì)血管血流信號的作用。大于15μm的血管腔被去除掉了。（c）毛細(xì)血管中頻（MF）圖，由300μm深度的3D頻率信號的正面投影生成。（d）MF分布及基線與dMCAO間的差異。（e）毛細(xì)血管通過時(shí)間（CTT）的分布及基線與dMCAO間的差異。（f）在基線和dMCAO時(shí)的Gamma函數(shù)。
結(jié)果
01-固有柔腦膜的側(cè)支化是卒中后快速逆向血流募集的原因
為確定固有側(cè)支如何在空間和時(shí)間上影響逆行血流，用寬視野Doppler OCT成像并量化遠(yuǎn)端MCA和ACA血流?；€時(shí)，檢測到MCA分支的流速從近端（S3）到遠(yuǎn)端（S1）梯度減?。▓D3a-c），而兩品系的血管直徑保持相對恒定（圖3d）。dMCAO后30 min，C57BL/6小鼠中觀察到強(qiáng)勁的MCA血流逆轉(zhuǎn)以及連接遠(yuǎn)端MCA和ACA的彎曲側(cè)支吻合，而Balb/C小鼠中沒有（圖3b）。dMCAO過程中，最靠近ACA和MCA間連接點(diǎn)的遠(yuǎn)端MCA小動(dòng)脈（圖3a中S1和S2）的血流速度顯著降低，C57BL/6組降到其基線值的56%和31%，Balb/C組降低更顯著，達(dá)基線值的0.2%和1.7%。此后C57BL/6組在dMCAO后7天，MCA小動(dòng)脈更近端段（S3）的流速和流量逐漸恢復(fù)了2-3倍（圖3b、c和e）。而Balb/C組S1和S2段的流速、血管直徑和流量在dMCAO后7天才顯示出程度明顯的恢復(fù)，可見功能性血流（圖3c-e）。使用DOCT評估的不同品系間MCA遠(yuǎn)端小動(dòng)脈中LMA血流募集的應(yīng)變差異，與激光多普勒血流計(jì)（LDF）評估的MCA區(qū)域的局部腦血流量（rCBF）差異相關(guān)（圖3f），表明側(cè)支血流的范圍可預(yù)測缺血區(qū)域的整體血流灌注狀態(tài)。
圖3 C57BL/6小鼠MCA遠(yuǎn)端閉塞后，從ACA快速募集逆行側(cè)支血流，但Balb/C小鼠沒有。（a）DOCT成像區(qū)域，對應(yīng)大腦背面染色灌注的軟腦膜血管圖像。圖示三個(gè)MCA遠(yuǎn)端分支的命名及其與MCA和ACA的相對位置。（b）C57BL/6和Balb/C小鼠基線（Base）、MCAO期間30min（dMCAO）、MCAO后24h和7天（7d）的代表性DOCT圖像。流向掃描探針束或ACA區(qū)域的血流為紅色，流向近端MCA的逆行血流為綠色。白色箭頭表接受來自ACA逆行血流的MCA分支。（c）C57BL/6和Balb/C小鼠的三個(gè)遠(yuǎn)端MCA段的流速、血管直徑（d）和流量（e）的對數(shù)柱狀圖?；€時(shí)，兩品系的流速、血管直徑或流量無顯著差異。但C57BL/6小鼠MCA的遠(yuǎn)端分支通過吻合被ACA逆行血流灌注，從紅色到綠色反向流動(dòng)。最靠近MCA主干的Seg3段的軸向流速和流量在MCAO后隨著時(shí)間推移逐漸增加。相反Balb/C組由于LMA側(cè)支網(wǎng)絡(luò)發(fā)育不良，在MCAO期間和之后24h幾乎沒有顯示逆行血流，導(dǎo)致MCA區(qū)域的流量一直顯著少于C57BL/6組。（f）LDF測定的閉塞部位的rCBF顯示血液灌注隨時(shí)間逐漸改善。在MCAO后第一天，不同品系間rCBF恢復(fù)情況差異顯著。
02-Balb/C小鼠中，卒中引起的MCA區(qū)域PA血流量減少會(huì)進(jìn)一步加劇
使用高分辨率Doppler OCT確定逆行的軟腦膜側(cè)支血流如何影響下游穿透小動(dòng)脈（PA）的血流。在直徑5mm的顱窗內(nèi)進(jìn)行掃描，覆蓋ACA和MCA區(qū)域，獲得OMAG和DOMAG掃描及正面流速圖譜（圖4a）。發(fā)現(xiàn)在MCAO后30min，C57BL/6和Balb/C小鼠MCA區(qū)域的總PA流量都顯著減少，分別減至基線水平的約13.7%和0.03%（圖4a和b）。盡管C57BL/6小鼠在同一時(shí)間點(diǎn)的LMA血流減少較緩和，但得到的數(shù)據(jù)與之前結(jié)論一致，即PA是大腦循環(huán)的瓶頸。C57BL/6小鼠MCA區(qū)域的PA血流在dMCAO后7天逐漸恢復(fù)到基線的49.3%，而Balb/C小鼠在同一時(shí)間點(diǎn)僅恢復(fù)到6.7%（圖4b）。品系間總流量的差異也反映在dMCAO階段未閉合PA的平均橫截面直徑上（圖4c）。兩品系小鼠dMCAO期間都檢測到ACA區(qū)域總流量減少，隨后7天內(nèi)分別恢復(fù)到基線的72%和64%（圖4e）。C57BL/6小鼠MCA區(qū)域PA的最大流速在dMCAO期間和dMCAO后7天顯著高于Balb/C小鼠（圖4d），而dMCAO期間兩品系A(chǔ)CA區(qū)域的趨勢相反（圖4g）。
圖4 卒中后Balb/C小鼠MCA區(qū)域PA血流幾乎耗盡，恢復(fù)很少。（a）兩品系小鼠皮質(zhì)表面下300 μm厚的組織內(nèi)，OMAG數(shù)據(jù)的正面MIP（上圖）和3D雙向DOMAG數(shù)據(jù)的正面MIP（下圖）。軸向速度范圍：±6.1 mm/s。確定了每個(gè)品系中MCA（b-d）和ACA（e-g）區(qū)域內(nèi)總流量、平均橫截面積和最大軸向流速的動(dòng)態(tài)變化。
03-Balb/C小鼠卒中后毛細(xì)血管通過時(shí)間的不均勻性較C57BL/6小鼠更顯著
評估并比較了兩品系dMCAO后毛細(xì)管通過時(shí)間的平均值和空間分布。在遮蔽直徑大于15μm的血管后，通過OCTA測速儀獲得毛細(xì)管平均頻（MF）圖譜（圖5a）。從圖2c紅色方框的MCA和ACA區(qū)域MF信號中推導(dǎo)出通過時(shí)間的空間分布特征，包括平均毛細(xì)血管通過時(shí)間（CTT）和毛細(xì)血管通過時(shí)間不均勻性（CTTH）。Balb/C小鼠在dMCAO后30min平均CTT增加，并在MCA區(qū)域頸總動(dòng)脈閉塞（CCAO）血流逆轉(zhuǎn)后1h持續(xù)，而ACA區(qū)域在dMCAO期間及后1天，平均CTT增加（圖5b和d），品系間無顯著差異。Balb/C小鼠中，卒中引起的CTTH增加一直持續(xù)，且dMCAO期間MCA區(qū)域的增加顯著多于C57BL/6組（圖5c和e），導(dǎo)致卒中后微血管阻力增加、氧提取減少。Balb/C小鼠ACA區(qū)域的CTTH在dMCAO后也增加了，但在隨后的7天恢復(fù)。品系間ACA區(qū)域的CTTH無顯著差異（圖5e）。
圖5 Balb/C小鼠卒中后，毛細(xì)血管通過時(shí)間的空間不均勻性顯著大于C57BL/6小鼠。（a）通過皮質(zhì)內(nèi)3D頻率信號正面投影生成的毛細(xì)血管平均頻率圖。Balb/C小鼠MCA（b）和ACA（d）區(qū)域的平均毛細(xì)血管通過時(shí)間（CTT）在dMCAO后顯著增加，并持續(xù)至CCAO逆轉(zhuǎn)后。卒中后CTTH增加，MCA區(qū)域（c）一直升高，Balb/C小鼠ACA（d）區(qū)域直到dMCAO后1天前一直升高。Balb/C小鼠dMCAO期間，CTTH的增加顯著多于C57BL/6小鼠。
04-C57BL/6和Balb/C小鼠固有腦血管的遺傳變異
為確定缺血性卒中后固有LMA側(cè)支的范圍是否有助于逆行血流補(bǔ)償，分析了DiI標(biāo)記的動(dòng)脈造影。基線時(shí)，C57BL/6小鼠ACA和MCA間相互連接的LMA吻合明顯多于Balb/C小鼠（圖6a和b），與以前的報(bào)告一致。而Balb/C小鼠PcomA開放性顯著好于C57BL/6小鼠（圖6c）。在三個(gè)不同神經(jīng)軸水平上，兩品系從中線到ACA和MCA區(qū)域邊界的距離相似（圖6d），表明兩品系小鼠大腦背半球MCA的相對面積相似，與以前的發(fā)現(xiàn)一致。
05-柔腦膜血流的快速募集可使梗死體積和神經(jīng)損傷更小
C57BL/6小鼠在dMCAO后7天，梗死面積較Balb/C小鼠減少更多、水平階梯和轉(zhuǎn)角測試評估的運(yùn)動(dòng)功能更好，表明快速LMA血流募集預(yù)示著更好的卒中結(jié)果（圖6e-g）。雖然Balb/C小鼠的血流流量和rCBF在dMCAO后7天有所改善，但這種晚期血流募集并不能挽救已經(jīng)因缺血而損失的腦組織，也不能改善卒中后的功能性結(jié)果。
圖6 MCAO前固有柔腦膜側(cè)支的范圍可預(yù)測C57BL/6和Balb/C小鼠的卒中結(jié)果。（a）兩品系小鼠動(dòng)脈造影背視圖。放大插圖顯示C57BL/6小鼠MCA和ACA血管網(wǎng)之間有許多吻合點(diǎn)，但Balb/C小鼠沒有。（b）MCA和ACA在基線時(shí)連接側(cè)支的量化。（c）兩品系小鼠Pcom開放性的評分和比較。（d）三個(gè)不同神經(jīng)軸水平上測定中線與ACA和MCA吻合線之間的距離。（e）Balb/C小鼠卒中后7天的卒中面積仍顯著大于C57BL/6小鼠。與卒中后7天的C57BL/6小鼠相比，Balb/C小鼠在高架水平梯測試（f）時(shí)滑過更頻繁，轉(zhuǎn)角測試（g）中同側(cè)轉(zhuǎn)彎明顯更多，反映出在感覺運(yùn)動(dòng)不對稱方面有更明顯的功能損傷。
結(jié)論
本研比較了兩種具有不同側(cè)支程度的近交系小鼠，證明了固有LMA側(cè)支對快速側(cè)支血流動(dòng)力學(xué)影響非常大，預(yù)先存在的固有側(cè)支化程度與卒中后快速LMA血流補(bǔ)償和下游血流動(dòng)力學(xué)改善有關(guān)。shouci使用DOMAG表明實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中，卒中引發(fā)的LMA側(cè)支招募取決于固有側(cè)支循環(huán)的范圍，還進(jìn)一步闡明了LMA側(cè)支血管下游的血液動(dòng)力學(xué)變化，確定了MCAO反應(yīng)中軟腦膜血管對快速和延遲血流募集的不同機(jī)制。
雖然以上研究證明側(cè)支循環(huán)范圍或狀態(tài)與缺血性損傷之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，但也存在獨(dú)立于側(cè)支循環(huán)、可調(diào)節(jié)梗塞體積的基因，表明缺血性損傷的生物反應(yīng)仍十分復(fù)雜。研究還表明單獨(dú)的血管新生對治療或預(yù)治療缺血性卒中可能效果不大；開放度較低的小血管的增加不會(huì)改善灌注情況，需要適當(dāng)大小的側(cè)支動(dòng)脈血管，與治療性血管重建領(lǐng)域觀點(diǎn)一致，即與血管新生相比，動(dòng)脈新生（小動(dòng)脈大小的增加）是一種更好的替代方法。
參考文獻(xiàn)：The impact of native leptomeningeal collateralization on rapid blood flow recruitment following ischemic stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2020):0271678X2094126.