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單掃描血管成像技術(shù)——光譜對比OCT血管造影術(shù)（SC-OCTA）
通常的OCT血管造影術(shù)依靠運(yùn)動來產(chǎn)生對比，并且每個掃描點(diǎn)至少需要采集兩次數(shù)據(jù)，不僅成像時間較長且受運(yùn)動狀態(tài)影響較大。美國學(xué)者James A. Winkelmann等提出了一種光譜對比OCT血管造影術(shù)的方法，即使用可見光，利用血管中內(nèi)源物質(zhì)不同的光譜特性，如血紅蛋白，實(shí)現(xiàn)單次掃描造影。研究證實(shí)該方法不但具有分子敏感性，還能夠成功區(qū)分出淋巴管、血液和組織。研究成果在2019年以“Spectral contrast optical coherence tomography angiography enablessingle-scan vessel imaging"為題發(fā)表于Light: Science & Applications。
研究背景
OCT是一種無創(chuàng)光學(xué)成像方式，可以微米級分辨率對組織形態(tài)進(jìn)行三維成像。除結(jié)構(gòu)信息外，對OCT信號的增強(qiáng)處理還能提供功能和分子信息。早期利用血管內(nèi)紅細(xì)胞運(yùn)動反向散射引起的多普勒相移來測量血流速度和描繪血管，稱為Doppler OCT。隨后利用相位方差、順序掃描減法和散斑方差等算法，增強(qiáng)了OCT中的脈管系統(tǒng)對比度。但基于運(yùn)動的OCT血管造影術(shù)也存在局限性，如對活體動物呼吸和脈搏運(yùn)動敏感，通常會導(dǎo)致投成像結(jié)果中出現(xiàn)亮帶偽影。
除基于運(yùn)動的OCT血管造影術(shù)之外，通過分辨不同光譜的吸收特征的SD-OCT（spectral domain OCT）在成像中也取得極大進(jìn)展。光譜可見波段OCT成像使生物組織帶上了真彩色。隨著可見光譜OCT的發(fā)展，通過內(nèi)源性造影劑定量血紅蛋白濃度和氧合，通過外源性納米顆粒造影劑獲得分子信息將成為可能。
本研究提出了一種新穎簡便的血管造影成像的方法，稱為SC-OCTA（spectral contrast OCT angiography）。SC-OCTA利用血紅蛋白的*光譜特征，無需重復(fù)掃描即可進(jìn)行3D血管造影，不僅能避免之前OCTA普遍存在的基于運(yùn)動的偽影，并實(shí)現(xiàn)了迄今為止最快的SD-OCT血管造影采集速度。此外，這種基于光譜的血管分割方法對血流運(yùn)動沒有要求，因此能夠?qū)χ寡M織中的脈管系統(tǒng)成像，如心血管疾病中受損脈管系統(tǒng)出血。
通常生物成像傾向于使用約700-900 nm的近紅外（near-infrared, NIR）區(qū)域，因?yàn)橄噍^于大于1000 nm的長波長，短波長能提供更高的OCT軸向分辨率，并且該區(qū)域落在“光學(xué)窗口"內(nèi)。在“光學(xué)窗口"中，水和血紅蛋白的吸收最小，使得光波能夠高度滲透入組織中。這不但使得NIR OCT系統(tǒng)能夠深入組織，同時降低了對血液和組織散射光譜特征的敏感性。血液吸收系數(shù)在400-600 nm內(nèi)會高兩個數(shù)量級，組織散射系數(shù)也會約為正常的兩倍，這使可見光OCT系統(tǒng)對血液氧化敏感，能獲得更高的圖像對比度。
SD-OCT通過對獲取的干涉記錄進(jìn)行傅立葉變換來獲取不同深度的樣本信息（圖1a）。通過短時傅里葉變換（STFT）對光譜進(jìn)行二次采樣，獲得光譜相關(guān)的OCT A-line。因此，通過觀察550-600 nm光譜相關(guān)OCT圖像強(qiáng)度的對比度，可以在空間上觀察到血液和組織的相反光譜斜率。研究人員在557和620 nm處發(fā)現(xiàn)Kaiser窗口，其半峰全寬（FWHM）約為38 nm，在血液和周圍組織之間呈現(xiàn)高光譜對比度。
結(jié)果與討論
為驗(yàn)證SC-OCT的成像能力，研究人員選擇人體下唇粘膜（唇內(nèi)側(cè)）進(jìn)行了成像對比研究。通過兩個Kaiser窗中OCT圖像強(qiáng)度的比值（620 nm除以557 nm），獲得人體下唇粘膜的體內(nèi)B-scan（圖1b），以下稱為SC-OCTA。在557 nm處的逆向OCT強(qiáng)度圖像中，以下稱為反向557 nm圖像，由于在可見范圍內(nèi)的高對比度和高吸收，可輕易觀察到血管。對于OCT系統(tǒng)，557 nm窗口和620 nm窗口的軸向分辨率分別為3.80和4.72 μm。根據(jù)比爾定律和米氏理論模擬，SC-OCTA方法只需一次掃描就能掃描到直徑約4 μ m的毛細(xì)管。
為證實(shí)毛細(xì)血管成像能力，比較了反向557 nm和SC-OCTA正面投影與傳統(tǒng)的OCTA相位和振幅對比結(jié)果（圖1c）。發(fā)現(xiàn)幾種成像圖中都可以看到唇粘膜中相同的八個毛細(xì)血管環(huán)，但傳統(tǒng)OCT血管造影術(shù)需要對樣本進(jìn)行至少兩次掃描。獲取傳統(tǒng)OCTA數(shù)據(jù)需要18.2 s，SC-OCTA數(shù)據(jù)需要4.5 s。傅里葉環(huán)相關(guān)分析得到傳統(tǒng)OCTA的有效分辨率為20.19 μm，反向557 nm的有效分辨率為12.2 μm，SC-OCTA的有效分辨率為8.92 μm。這一分析表明相較于OCTA，反向557 nm和SC-OCTA對體內(nèi)運(yùn)動不敏感。唇粘膜的詳細(xì)大視野證明了SC-OCTA在每個點(diǎn)掃描位置僅用一條A-line就能分辨出小動脈和毛細(xì)血管（圖1d，e）。此外反向557 nm圖像無法區(qū)分低散射結(jié)構(gòu)和血紅蛋白吸收，圖1d中可見白色箭頭所示的唾液腺導(dǎo)管，但在SC-OCTA圖像中不可見（圖1e）。
圖1 人唇粘膜的活體成像。a.可見光OCT系統(tǒng)的簡化示意圖，可獲得樣本的3D光譜信息。b-e.健康志愿者唇粘膜（下唇）的活體成像。b.反向557 μm和反向620 μm的B-scan及其相應(yīng)的STFT窗口，以及顯示每個血管對比陰影的SC-OCTA B-scan。c.表面毛細(xì)血管環(huán)的血管造影正面投影與傳統(tǒng)運(yùn)動對比OCTA（64–111 μm）的比較、反向557 μm（55.6–140 μm）和SC-OCTA（83–209 μm）的表面毛細(xì)血管環(huán)的正面投影，及其相應(yīng)的投影強(qiáng)度的比較。d.反向557 nm的3D渲染。e.與圖d同一視場的深度編碼血管圖，包含來自SC-OCTA的飽和度和數(shù)值，以及來自反向557 nm的血管深度色調(diào)。紅色方框?yàn)槊?xì)管回路放大圖。d和e中白色箭頭為SC-OCTA正確未識別的唾液腺導(dǎo)管。
因?yàn)镾C-OCTA不依靠運(yùn)動來進(jìn)行對比，所以它可以對不流動的血液和高度運(yùn)動的樣本進(jìn)行成像。研究人員制作了一個直徑約為55 μm的牛血管模型，并記錄了不同流量（圖2）和振動下SC-OCTA和OCTA信號的信噪比。結(jié)果表明，與OCTA相比，SC-OCTA信號受流動的影響不顯著，因此可以對高度運(yùn)動的樣本成像。
圖2 牛血管模型成像。不同流動條件下SC-OCTA和OCTA的正面投影和相應(yīng)的信噪比。SC-OCTA（流動：22.76 ± 1.42；2 min：21.99 ± 1.95；15 min：14.08 ± 1.30）。OCTA（流動：7.69 ± 1.13；2 min：5.74 ± 1.21；15 min：2.35 ± 0.60）。在流量測量過程中，模型血液灌注量為0.0006 μL/s，然后在停止灌注后2 min和15 min進(jìn)行測量?？梢娫诠嘧⑼Ｖ购? min，SC-OCTA信噪比沒有受到顯著影響，但15 min后由于血液濃度降低，信噪比受到顯著影響。
為證明SC-OCTA在止血情況下的效用，對新處死的小鼠大腸的漿膜表面進(jìn)行了成像（圖3）。這是已知的shouci使用OCT對具有內(nèi)源性造影劑的非運(yùn)動血液的組織進(jìn)行血管造影。結(jié)果表明，OCTA在止血情況下難以分辨出任何血管，而SC-OCTA可以快速檢測到幾個血管（圖3a）。
圖3 小鼠大腸漿膜面止血成像。a. SC-OCTA和OCTA的正面投影和B-scan（藍(lán)色虛線位置）對比。白色箭頭為SC-OCTA（56–280 μm）和OCTA（28–33 μm）探測到的同一血管。可見在止血的情況下，SC-OCTA成像效果依舊良好，而OCTA甚至難以識別出大血管。b.大視野SC-OCTA，帶有飽和度和值以及反向557 nm的血管深度色調(diào)。圖為漿膜表面成像，位于大腸管腔側(cè)表面正下方的低信號毛細(xì)血管環(huán)在SC-OCTA掃描中未能清晰顯示。
為證明SC-OCTA的分子敏感性，對新處死的小鼠網(wǎng)膜淋巴管和血管（圖4a-d）以及心臟表面進(jìn)行成像，并將同一心臟表面的成像圖與組織學(xué)成像進(jìn)行比較（圖4e-g）。發(fā)現(xiàn)SC-OCTA能夠?qū)⒀軓牡蜕⑸涞牧馨凸芎椭炯?xì)胞中區(qū)分出來。結(jié)合SC-OCAT和反向557 nm圖像得到的depth-integrated SC-OCTA，其B-scan能夠在三維空間顯示出血管信息（圖4），能夠在毛細(xì)血管水平將唇粘膜脈管系統(tǒng)從唾液腺導(dǎo)管和組織中區(qū)分出來。此外depth-integrated SC-OCTA還展現(xiàn)出冠狀動脈分支成像的能力，并能將其與鄰近的淋巴管區(qū)分開來（圖4e）。高分辨率和對比度還允許對淋巴管進(jìn)行成像，能夠輕易辨別出其中瓣膜的三尖瓣結(jié)構(gòu)（圖4d）。
圖4 小鼠血管和淋巴管成像。前腹壁（a-d）。心表面（e-g）。a.反向557 nm、SC-OCTA和depth-integrated SC-OCTA的B-scan比較。綠色箭頭：血管；白色箭頭：淋巴管；紅色箭頭：脂肪細(xì)胞。b.側(cè)視剝離圖，depth-integrated SC-OCTA展示血管（綠色），移除血管的反向557 nm展示脂肪/淋巴組織（白色/橙色），全光譜505–695 nm OCT顯示高度散射的組織（灰色）。c.顏色編碼的3D渲染。depth-integrated SC-OCTA（綠色）顯示血管，反向557 nm（白色/橙色）顯示脂肪細(xì)胞（紅色星號）和淋巴管（黑色箭頭）。藍(lán)色虛線為a橫截面位置。d. c中黑框內(nèi)淋巴管瓣膜1 （LV1）和淋巴管瓣膜2 （LV2）的3D渲染和B-scan橫截面圖，顯示出三尖瓣結(jié)構(gòu)。e.顏色編碼的3D渲染。depth-integrated SC-OCTA （綠色）顯示血管，反向557 nm（白色/橙色）顯示白色淋巴管。f. e的俯視圖，顯示血管分支（黃色箭頭）和淋巴管（白色箭頭）。g.相應(yīng)的免疫熒光顯微圖。
全文小結(jié)
本研究展示了一種基于可見光譜OCT的血管及組織成像方法，能夠以單次掃描實(shí)現(xiàn)分子靈敏度的三維成像。隨著OCTA算法的持續(xù)優(yōu)化，有希望將可視OCT用于內(nèi)窺鏡檢查，以實(shí)現(xiàn)具有分子靈敏度的微創(chuàng)體內(nèi)成像。 參考文獻(xiàn)：Winkelmann, James A. , et al. "Spectral contrast optical coherence tomography angiography enables single-scan vessel imaging." Light: Science & Applications 8.1(2019).