iElisa 玉米赤霉醇檢測試劑盒 

iElisa 玉米赤霉醇檢測試劑盒 

2. 概要 玉米赤霉醇（zeranol，ZER），屬于雷索酸內(nèi)酯 類非甾體同化激素。ZER 作為牛羊促生長劑，以耳 根埋植的形式應(yīng)用，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，能提高胴 體瘦肉率及飼料轉(zhuǎn)化率。但是，玉米赤霉醇具有弱 雌激素作用，在動物尿液中的殘留會引起人體性機(jī) 能紊亂及影響第二性征的正常發(fā)育，在外部條件誘 導(dǎo)下，還可能致癌。ZER 排出動物體外后，還可經(jīng) 飲水和食物造成二次污染及環(huán)境污染。1998 年歐盟 禁止將玉米赤霉醇等激素類藥物應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖， 我國農(nóng)業(yè)部第 235 號公告明確規(guī)定玉米赤霉醇禁用 于所有食品動物，所有可食動物尿液不得檢出。 3. 原理 測定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有 抗抗體。加入玉米赤霉醇（ZER）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、 酶標(biāo)抗原和抗體后，游離的玉米赤霉醇與酶標(biāo)抗原 競爭結(jié)合抗體，抗體或抗體結(jié)合物與固定在微孔板 上的抗抗體再結(jié)合，沒有結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)抗原 及抗體被洗去，加入 TMB 底物顯藍(lán)色，加入終止 液后顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀在 450nm 處檢測，吸 光值與樣品中玉米赤霉醇含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲 線比較即可得出玉米赤霉醇的含量。 4. 試劑盒的組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條 ×8 孔） 2) 玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/ml 、0.5ng/ml、 2.0ng/ml、5.0ng/ml、15.0ng/ml、50.0ng/ml； 1 瓶 × 1.0ml 3) ZER酶標(biāo)抗原： 1 瓶 ×10ml 4) ZER抗體： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) 復(fù)溶液 1 瓶 × 30ml 7) 稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 8) 稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 9) 稀釋緩沖液C: 1 瓶 ×50ml 10) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 11) 終止液： 1 瓶 × 7ml 12) 試劑盒說明書： 1 份 13) 質(zhì)檢報(bào)告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器） —酶標(biāo)板振蕩器 —渦旋混合器 —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —定性濾紙 —過濾漏斗 —天平：感量 0.01g —吹干器 —勻質(zhì)器 2） 試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 純水，混勻。 —純水（蒸餾水、去離子水） —吹干器 —勻質(zhì)器 5. 樣品處理 5.1 牛肉樣品： 1） 稱取1.0g勻質(zhì)肉樣，加入2ml去離子水,加入8μl 葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，水浴 37℃ 2h。 2） 取出后，加入 8ml 乙腈，振蕩 20min。離心 3000r/min 10min。 3） 取 5ml 上清液于另一干凈離心管中，加入 2ml 三氯甲烷和 6ml 正己烷，渦旋 30s，振蕩 20min。 3000r/min 離心 10min。 4） 去除上層正己烷，*去除中間層與另一試管 中，吹干后，用 1ml 復(fù)溶液復(fù)容。 5） 用稀釋緩沖液 A 按 1：4（5 倍稀釋）的比例稀 釋（吸取 100μl 復(fù)溶液，加入 400μl 稀釋液緩 沖液 A）。 稀釋倍數(shù)：105.2 牛奶樣品 14) 取 1.0ml 新鮮牛奶，加入 8μl 葡萄糖醛酸酶/芳 基硫酸酯酶，水浴 37℃ 2h。 15) 用稀釋緩沖液 B 按 1：9（10 倍稀釋）的比例 稀釋（吸取 50μl 樣品，加入 450μl 稀釋液緩沖 液 B）。 稀釋倍數(shù)：10 5.3 尿液樣品 1) 取 2.0ml 尿液于離心管中，室溫 3000r/min， 10min，離心，取 1ml 澄清尿液于另一離心管 中，加入 10μl 葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶， 水浴 37℃ 3h。 2) 取出后加入 5ml 三氯甲烷，振蕩 20min，室溫 3000r/min，10min，離心。 3) 取 2.5ml 下層溶液液于一干凈試管中吹干，用 1.0ml 復(fù)溶液復(fù)容。 4) 用稀釋緩沖液 B 按 1：4（5 倍稀釋）的比例稀 釋（吸取 100μl 復(fù)溶液，加入 400μl 稀釋液緩 沖液 B）。 稀釋倍數(shù)：10 5.4 飼料樣品 1) 稱取 2.0g 粉碎樣品，加入 10ml 乙腈-0.1mol/L NaOH，振蕩 20min，室溫離心 3000g，10min。 取 1ml 上清液，50℃，氮?dú)獯蹈伞?2) 用 0.5ml 三氯甲烷溶解，加入 2ml 1mol/L NaOH，振蕩 10min，室溫離心 3000r/min， 10min。取 1ml 上清液，加入 100μl 6M H3PO4 再加入 5ml 三氯甲烷，振蕩 10min，室溫離心 3000r/min，10min。取 2.5ml 下層底液，50℃ 吹干。再用 1ml 復(fù)溶液復(fù)容。 3) 用稀釋緩沖液 C 按 1：9（10 倍稀釋）的比例 稀釋（吸取 100μl 復(fù)溶液，加入 900μl 稀釋液 緩沖液 C）。 稀釋倍數(shù)：200 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測定之前注意事項(xiàng) 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有溫育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制: 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子 水） 2) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 濃縮液+90 ml 純 水, 可以用于 32 孔的檢測）。 3) 0.1mol/L NaOH: 0.4g NaOH 溶解到 100ml 水中 4) 1 mol/L NaOH ：4g NaOH 溶解到 100ml 水中 5) 乙腈-0.1 mol/L NaOH：90ml 乙腈中加入 10ml 0.1M NaOH 6) 6 mol/L 磷酸：100ml 濃磷酸加入 150ml 水 6.3 測定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl 的 ZER 酶標(biāo)抗 原，再加入 50μl 的 ZER 抗體，加蓋，在室溫 溫育 30 分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新 的吸頭）。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 每孔加入150μl底物，室溫避光溫育10分鐘。 5) 每孔加入50μl 終止液。 6) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參比波長630nm。（iElisa全 自動酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。 7. 結(jié)果判定 1) 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為 X 軸， 百分吸光度值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每 一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專 業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例進(jìn)行稀釋。 8. 注意事項(xiàng) 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況， 則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定結(jié)果不 準(zhǔn)確。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 1) 試劑盒靈敏度: 0.5ppb 2) 試劑盒變異系數(shù)：小于 20%。 3) 試劑盒準(zhǔn)確度：回收率范圍在 60％-120％之 間。