PPB即表示與血漿蛋白結(jié)合形成結(jié)合態(tài)藥物的比例。游離藥物假說(shuō)認(rèn)為僅有游離態(tài)的藥物才能擴(kuò)散透過(guò)生物膜，到達(dá)靶部位發(fā)揮藥效；另外游離藥物的比例還顯著影響藥物分布、代謝和排泄的過(guò)程，PPB與藥物的諸多藥理性質(zhì)均有關(guān)。
影響PPB測(cè)定的因素很多，如溶解度、溫度、非特異性結(jié)合、酯酶代謝等，需根據(jù)化合物的特征，結(jié)合研究的實(shí)際目的，選擇合適的測(cè)定方法反應(yīng)真實(shí)的化合物特性。需根據(jù)化合物預(yù)期治療濃度，個(gè)性化的制定試驗(yàn)濃度，必要時(shí)進(jìn)行不同濃度條件下的PPB測(cè)定。其中對(duì)于*蛋白結(jié)合率的化合物，試驗(yàn)的微小偏差即會(huì)對(duì)結(jié)果造成較大的相對(duì)偏差，此時(shí)還需要同步優(yōu)化精密度更高的LC-MS/MS、放射性等檢測(cè)分析技術(shù)。
平衡透析法目前是常用的方法，但也存在一定的缺陷，如初始平衡狀態(tài)的改變、非特異性結(jié)合、體積變換、Donnan效應(yīng)和蛋白滲漏等。
初始平衡狀態(tài)的改變是指當(dāng)游離藥物穿過(guò)半透膜時(shí)會(huì)形成新的游離態(tài)-結(jié)合態(tài)的平衡，由此造成試驗(yàn)設(shè)置濃度與實(shí)際平衡濃度的差異，對(duì)于PPB存在濃度依賴(lài)特性的化合物可能造成結(jié)果的偏差。
非特異性結(jié)合是指藥物與半滲透膜等試驗(yàn)裝置的結(jié)合，可能造成游離藥物濃度的低估，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果。通常采用聚四氟乙烯(Teflon)制造的試驗(yàn)裝置以降低非特異性結(jié)合的影響。如果非特異性結(jié)合現(xiàn)象比較嚴(yán)重建議采用超速離心法。
體積轉(zhuǎn)換是指液體在膠體滲透壓的作用下從buffer側(cè)移動(dòng)至蛋白側(cè)，由此稀釋蛋白濃度對(duì)結(jié)合率較低的化合物試驗(yàn)結(jié)果造成影響。當(dāng)液體轉(zhuǎn)換比例低于10%時(shí)該效應(yīng)幾乎忽略，孵育時(shí)間超過(guò)4h可能會(huì)加劇該效應(yīng)，可以通過(guò)在buffer側(cè)加入右旋糖酐以平衡兩側(cè)滲透壓。
Donnan效應(yīng)是指吉布斯-唐南效應(yīng)，是指帶電粒子不通過(guò)半透膜而產(chǎn)生不均勻的電荷，使兩側(cè)粒子濃度不一致。尤其對(duì)于高離子化且低蛋白結(jié)合的藥物，該效應(yīng)最為明顯，該效應(yīng)可以通過(guò)增加buffer側(cè)電解質(zhì)的濃度來(lái)弱化。
當(dāng)半透膜完整性出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)會(huì)發(fā)生蛋白滲漏現(xiàn)象，對(duì)于高蛋白結(jié)合率化合物，由此會(huì)造成游離藥物比例的顯著高估，尤其在孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)易發(fā)生。
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