相信很多開發(fā)HPLC方法的實驗研發(fā)人員都開發(fā)出了無法分離混合物重要成分的方法，其方法可以是調(diào)整流動相、固定相或柱溫,另一種有效的方法是改變色譜柱粒徑。粒徑較小的液相色譜柱產(chǎn)生較高的塔板數(shù)以獲得更尖銳的峰，并且能夠分離緊密洗脫的峰。一些高分子量化合物在小孔徑填料上可能無法分離，但在用大孔徑填料填充的色譜柱上很容易分離。
通常解決緊密或共洗脫峰的有效的方法是改變流動相組成或柱填料顆粒的鍵合相功能 。分辨率方程清楚地確定了影響峰分辨率的三個主要因素：其中Rs是兩個靠近洗脫峰的分辨率（間距）；k是代表保留的容量因子；α 是靠近洗脫峰的容量因子的比率；N為代表柱效的柱塔板數(shù)。反相 HPLC 是一種非常強大的方法，通?？梢院敛毁M力地實現(xiàn)分離，有時甚至只需要初始操作條件。然而，重疊和疊加的峰通常會產(chǎn)生，因此需要改變操作條件。有幾種方法可以提高重疊峰的分辨率或帶間距，或者解耦疊加的峰。
一、相對保留的調(diào)整：
有時可以通過調(diào)整容量因子k（保留）值來對分離不嚴(yán)重重疊的峰進行微小改進降低流動相的強度。
二、通過提高柱效提高分離度：
適度重疊的峰通?？梢酝ㄟ^提高柱效來解決，通過增加柱塔板數(shù)來銳化峰（減少峰體積）。一種有效的方法是使用顆粒較小的色譜柱，因為這會增加塔板數(shù)并提高柱效。
三、通過改變流動相有機改性劑增加譜帶間距：
在反相 HPLC 中改善譜帶間距的有效方法是改變流動相成分以增加 α 值。如果在初始分離中觀察到嚴(yán)重重疊或疊加的峰，則此方法更適合。改變有機改性劑是產(chǎn)生峰間距變化的有效途徑。例如，如果初始分離使用乙腈作為有機改性劑并顯示出此問題，建議的方法是更換改性劑：先換成甲醇或再換成四氫呋喃。
根據(jù)實際情況，有時可以通過增加柱塔板數(shù)、使用更小的顆粒或增加柱長來改善分離。但這些方法的缺點是較高的操作壓力和較長柱的分離時間增加。其中有效的方法是改變流動相有機改性劑或色譜柱功能，在這種情況下分離時間不會增加，有時可以縮短以實現(xiàn)更快的分離。對于肽和蛋白質(zhì)等大分子，使用孔徑較大的色譜柱顆粒很重要。
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