SP(小鼠/兔IgG)-POD Kit說明書

產(chǎn)品貨號：M20313

產(chǎn)品規(guī)格：3ml/6ml/18ml

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒適合于一抗為小鼠/兔IgG的免疫組化實驗DAB顯色。SP試劑盒是專為免疫組化和其他免疫檢測而設(shè)計的，用以顯示組織和細(xì)胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，同親和素一樣，對生物素有的親和力，親和素是一個堿性蛋白質(zhì)（PI=10），經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點接近中性，對組織和細(xì)胞的非特異吸附很低，因此基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。

產(chǎn)品組成：

操作步驟:（以石蠟切片為例）

1. 切片常規(guī)脫蠟至水(三次二甲苯，三次乙醇)。

2. 3% H2O2室溫處理5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。

3. 可選步聚：

a. 熱修復(fù)抗原，將切片浸入0.01M檸檬酸鈉緩沖液（PH6.0），電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后，反復(fù)1-2次。冷卻后PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。

b. 酶消化，滴加消化液，37℃10分鐘，PBS（pH7.2-7.4）洗滌2-3次。

c. 跳過此步，直接進(jìn)入下一步。

4. 滴加封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，免洗。

5. 用稀釋液將一抗按一定比例稀釋（稀釋后的一抗4℃可保存一周），也可另行購買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗37℃孵育1小時左右或20℃2小時左右，也可4℃過夜。PBS（pH7.2-7.4）洗滌3次，每次2分鐘。（一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來說，陽性染色強(qiáng)度不夠時，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間；背景過高時，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時間。）

6. 根據(jù)用量，用稀釋液將Bio-羊抗小鼠/兔IgG濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ulBio-羊抗小鼠/兔IgG濃縮液混勻，此工作液4℃可保存一周)。滴加Bio-羊抗小鼠/兔IgG工作液，20-37℃孵育30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗滌3次，每次2分鐘。

7. 根據(jù)使用量，用稀釋液將鏈酶親和素-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul鏈酶親和素-POD濃縮液混勻，此工作液4℃可保存一周)。滴加鏈酶親和素-POD工作液，20-37℃，30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗滌4次，每次5分鐘。

8. DAB顯色：根據(jù)用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1ml PBS加入50ul 20×DAB顯色液A，加入50ul 20×DAB顯色液B 。充分混勻后滴加到切片上。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。 蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。 對于細(xì)胞爬片，固定后，PBS漂洗兩次，再用0.5% Triton X-100 室溫孵育20分鐘，PBS漂洗兩次，3% H2O2處理15分鐘；PBS漂洗兩次，接上述第4步。對于冰凍切片，固定后，PBS漂洗兩次，接上述第二步。

注意事項：

如果染色背景過高，在SP反應(yīng)之后，DAB顯色之前，用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然后DAB顯色。

保存：

如果長時間不使用，請將所有試劑存放于-20℃，如經(jīng)常使用，可將封閉液，3% H2O2和20×DAB顯色液B存放于2-8℃以方便使用。