各位奮戰(zhàn)在科研前線的戰(zhàn)友們，你們是否曾在凌晨三點(diǎn)的細(xì)胞房里，在顯微鏡下盯著細(xì)胞培養(yǎng)瓶里可疑的那些小黑點(diǎn)，糾結(jié)這到底是細(xì)胞碎片還是污染，這細(xì)胞還能做實(shí)驗(yàn)嗎？事實(shí)上，細(xì)胞碎片和微生物污染都有其明顯的特征，了解這些特征，我們就能夠簡(jiǎn)單有效地將它們區(qū)分開(kāi)。
01
細(xì)胞內(nèi)黑點(diǎn)和細(xì)胞外黑點(diǎn)的區(qū)分
細(xì)胞內(nèi)黑點(diǎn)：首先需要明確的是，細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒既不是碎片也不是污染，是細(xì)胞器及細(xì)胞外分泌泡，屬于細(xì)胞自身的結(jié)構(gòu)及特性。不同類型的細(xì)胞，胞內(nèi)顆粒的數(shù)量可能不同。培養(yǎng)條件也會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)顆粒的數(shù)量。
▲ 細(xì)胞內(nèi)黑色顆粒為自身結(jié)構(gòu)特性
細(xì)胞外黑點(diǎn)：通常為細(xì)胞碎片、細(xì)胞代謝產(chǎn)物或血清中的磷酸鈣沉淀（此文中統(tǒng)稱為碎片），常常與污染混淆。
02
常見(jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)微生物污染類型
最常見(jiàn)的微生物污染為細(xì)菌、真菌、支原體污染。真菌與碎片差別很大，真菌通常為白色圓球狀或白色菌絲狀，碎片是小黑點(diǎn)，不難區(qū)分。
▲ 真菌污染的兩種典型特征
而支原體用光學(xué)顯微鏡是看不見(jiàn)的，必須要用PCR等實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行檢測(cè)。在此不做贅述。
然而，細(xì)菌（特別是球狀細(xì)菌）與碎片卻極為相似，顯微鏡下呈現(xiàn)為小黑點(diǎn)，分布于細(xì)胞周圍。區(qū)分細(xì)菌和碎片則是此文的重點(diǎn)。
03
從形態(tài)、運(yùn)動(dòng)和增殖特點(diǎn)區(qū)分碎片和細(xì)菌
4倍或10倍物鏡觀察，可以初步判斷黑點(diǎn)分布情況，但看不清形態(tài)，不容易判斷。所以我們首先要將物鏡調(diào)到20或40倍，再進(jìn)一步觀察黑點(diǎn)的特征。主要從三個(gè)方面來(lái)判斷：1. 形態(tài)特點(diǎn) 2. 運(yùn)動(dòng)方式 3. 是否增殖。
● 看形態(tài)
碎片通常是不規(guī)則的，有圓形有多邊形，大小不一，分布不均勻。細(xì)菌形態(tài)規(guī)則，呈桿狀、球狀或線狀，具有高度重復(fù)性，分布較為均勻。
▲ 左：細(xì)胞碎片 右： 細(xì)菌污染
● 看運(yùn)動(dòng)
碎片可分為貼壁或懸浮兩種狀態(tài)：貼壁的碎片不會(huì)自主運(yùn)動(dòng)，而懸浮的細(xì)胞碎片會(huì)隨液體輕微震動(dòng)或緩慢飄動(dòng)（越小的碎片越容易震動(dòng)，震動(dòng)頻率越高）。
細(xì)胞碎片或分泌物是細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的，正常培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞代謝和死亡無(wú)可避免，大多細(xì)胞系都會(huì)有類似情況，只是不同細(xì)胞系碎片顆粒多少會(huì)有區(qū)別。顆粒會(huì)動(dòng)是基于高中時(shí)期所學(xué)基本物理原理-布朗運(yùn)動(dòng)，根據(jù)其他細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞照片情況，只要拍攝比較清晰的，都可以看到細(xì)胞外黑色顆粒,這些碎片只要是懸浮在液體里都會(huì)做布朗運(yùn)動(dòng)。JCRB細(xì)胞庫(kù)延時(shí)攝影信息可以更明顯觀測(cè)到碎片位置變化，是布朗運(yùn)動(dòng)的時(shí)間積累結(jié)果。
▲ 細(xì)胞生長(zhǎng)延時(shí)攝影（來(lái)源：JCRB細(xì)胞庫(kù)）
細(xì)菌不會(huì)貼壁，無(wú)鞭毛的細(xì)菌不會(huì)運(yùn)動(dòng)；有鞭毛的細(xì)菌會(huì)定向游動(dòng)、原地打轉(zhuǎn)、震動(dòng)，細(xì)菌這幾種運(yùn)動(dòng)方式經(jīng)常是同時(shí)存在的。細(xì)菌相比于碎片，運(yùn)動(dòng)速度要快得多，運(yùn)動(dòng)幅度也會(huì)更大。
▲ 碎片隨著液體輕微震動(dòng)
▲ 細(xì)菌快速運(yùn)動(dòng)
● 看增殖
碎片不會(huì)增殖，但細(xì)胞逐漸死亡或細(xì)胞密度增大，碎片都會(huì)逐漸增多。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的血清也會(huì)緩慢析出沉淀，導(dǎo)致黑點(diǎn)變多。但培養(yǎng)基不會(huì)渾濁。
現(xiàn)在我們大部分時(shí)候培養(yǎng)細(xì)胞都會(huì)加1%青鏈霉素雙抗（也稱為P/S）預(yù)防細(xì)菌污染，然而有一些細(xì)菌不在P/S抗菌譜中，一旦落入培養(yǎng)基就會(huì)開(kāi)始增殖。
大部分細(xì)菌會(huì)在1-2天內(nèi)爆發(fā)式生長(zhǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁，肉眼可見(jiàn)流沙狀物質(zhì)。
也有少數(shù)種類細(xì)菌會(huì)受到雙抗的影響，增殖速度沒(méi)那么快。當(dāng)比較難判斷的時(shí)候，我們可以使用不含雙抗的培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，觀察黑點(diǎn)的增殖情況。
▲ 細(xì)菌污染導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁
04
涂平板菌檢
如果通過(guò)以上三種方法還是難以判斷，還有一招——將培養(yǎng)上清涂布細(xì)菌培養(yǎng)平板進(jìn)行驗(yàn)證：取細(xì)胞培養(yǎng)上清，無(wú)菌環(huán)境下涂布細(xì)菌專用的固體培養(yǎng)基平板，置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-72h，觀察是否產(chǎn)生菌落。此方法更準(zhǔn)確，但要求實(shí)驗(yàn)室有微生物培養(yǎng)設(shè)備和材料，同學(xué)們可以根據(jù)自己的實(shí)際情況選擇合適的方法。
▲ LB平板菌檢（左：陽(yáng)性 右：陰性）
總之，面對(duì)細(xì)胞中的小黑點(diǎn)，我們無(wú)需過(guò)分恐慌。只要我們深入了解細(xì)胞碎片與微生物污染的特征，并掌握正確的判斷方法，便能輕松應(yīng)對(duì)。
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