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肉毒梭菌毒素酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 試劑盒使用說明書 本試劑盒僅供研究使用。 1 使用目的： 本試劑盒用于肉類組織（如雞、牛肉和豬肉），血清和尿樣中肉毒梭菌毒素殘留的定量 檢測。 2 實(shí)驗(yàn)原理 本試劑盒采用競爭 ELISA 方法，在微孔板包被有肉毒梭菌毒素偶聯(lián)抗原，加入肉毒梭 菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離肉毒梭菌毒素與微孔條上預(yù)包被的肉毒梭菌毒素偶聯(lián)抗原互相競 爭抗肉毒梭菌毒素抗體酶標(biāo)記物，用 TMB 底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色， 用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中肉毒梭菌毒素含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn) 曲線計(jì)算樣品中肉毒梭菌毒素的含量。 3 試劑盒組成 3.1 預(yù)包被的肉毒梭菌毒素偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1 塊（12 孔×8 條）。 3.2 肉毒梭菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：6 瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb。 3.3 抗肉毒梭菌毒素抗體酶結(jié)合物：1 瓶（6ml）。 3.4 顯色液 A：1 瓶（6ml）。 3.5 顯色液 B：1 瓶（6ml）。 3.6 終止液：1 瓶（6ml），2M 硫酸。 3.7 樣本稀釋液：1 瓶（10×, 6ml），用于樣品稀釋用。 3.8 濃縮洗滌液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。 3.9 說明書一份。 4 需要而未提供的材料 4.1 設(shè)備 4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀。 4.1.2粉碎機(jī)。 4.1.3量筒。 4.1.4振蕩器。 4.1.5漏斗。 4.1.6Whatman No 1或相當(dāng)?shù)臑V紙。 4.1.7微量移液器。 4.2 試劑 4.2.1去離子水或蒸餾水。 4.2.2 甲醇。 5 貯存 5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍 5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存 6 注意事項(xiàng) 6.1 使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書。2 6.2 不要使用過期試劑盒。 6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。 6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有肉毒梭菌毒素，使用時(shí)應(yīng)特別注意，操作時(shí)應(yīng)帶手套。 6.5 終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。 6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。 6.7 不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會(huì)影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 6.8 稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 6.9 混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。 7 工作液準(zhǔn)備 7.1 肉毒梭菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb 7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用 7.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用 7.3 顯色劑：已備用，避免光線直照 7.4 反應(yīng)終止液：已備用 8 樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則 會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存） 8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液 8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘 8.3用Whatman No 1濾紙過濾 8.4取25µl處理后的樣品，加入25µl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2） 9 酶免分析步驟 9.1 實(shí)驗(yàn)須知 9.1.1 實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)?；販刂潦?溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存 注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準(zhǔn)確度。 9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存 9.1.3 請不要改變分析程序 9.1.4 請使用精確的微量移液器 9.1.5 操作一旦開始，請不要中斷任何程序 9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作 9.1.7 為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣 9.1.8 加樣時(shí)請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面 9.2 分析步驟 9.2.1 預(yù)*行編號(hào)，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測 9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存 9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋) 9.2.4 在B0孔中加入50µl 0.0ppb標(biāo)準(zhǔn)品溶液 9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 9.2.6 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液 9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗肉毒梭菌毒素抗體酶結(jié)合物 9.2.8 輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘。 9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差） 9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，最后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液3 體。9.4 反應(yīng) 9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50µl顯色液A，再加 50µl顯 色液B；輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之*混勻 9.4.2 37℃溫浴10min 9.4.3 每孔中加入50µl終止液，混勻 9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。 10 結(jié)果計(jì)算 10.1定量分析 10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)） 的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。 B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 10.1.2以肉毒梭菌毒素濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣 品百分吸光度值，可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為肉毒梭菌毒素濃度的對(duì)數(shù)值，求得 反對(duì)數(shù)即為測定液中肉毒梭菌毒素濃度C（ppb） 10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋 倍數(shù)。 10.2 半定量測定 10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色 深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。 10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光 度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。 11 特異性 物質(zhì) 交叉反應(yīng) 肉毒梭菌毒素 100% 12 試劑盒參數(shù) 本試劑盒檢測下限為0.05ppb B0吸光度最佳值應(yīng)大于1.0 試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。 用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。 13試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb。 14 分析限制 本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。