生物學(xué)研究與臨床經(jīng)常需要使用到紅細(xì)胞，然而血液紅細(xì)胞的采集過程比較繁瑣，并且有些珍貴血液采集機(jī)會(huì)難得，所以就需要有效的保存液來維持所采集的紅細(xì)胞的活性。然而，目前大部分血液是在4℃的冰箱保存，保存時(shí)間僅為20天左右，難以滿足長(zhǎng)時(shí)間保存的需要；此外，紅細(xì)胞的保存液多采用常溫下的短期保存和深低溫下的長(zhǎng)期保存，因此保存和運(yùn)輸存在很大困難。并且隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，紅細(xì)胞易被氧化損傷，紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其穩(wěn)定性及功能性。
01 應(yīng)用背景
近年來，對(duì)于蛋白及紅細(xì)胞的保存大多是采用冷凍干燥技術(shù)，即通過低溫與真空條件的控制，一方面能使蛋白及紅細(xì)胞中的熱敏成分與易氧化成分不被破壞損傷，另一方面還能阻止微生物生長(zhǎng)以及水為介質(zhì)的生化反應(yīng)等，從而使蛋白及紅細(xì)胞保持其原有的生物活性。通過冷凍干燥后的紅細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)常溫下的長(zhǎng)時(shí)間保存，并且其性能穩(wěn)定、輸注方便、便于運(yùn)輸，在新醫(yī)療領(lǐng)域具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
然而，紅細(xì)胞在凍干及復(fù)水的過程中極易受到外界的影響，導(dǎo)致紅細(xì)胞凍干后復(fù)水的存活率不是很高；而且目前研發(fā)的細(xì)胞凍干保護(hù)劑存在成分復(fù)雜、凍存工藝參數(shù)不易控制等缺陷，使得紅細(xì)胞存活率低、凍存紅細(xì)胞易發(fā)生形態(tài)變異、凍干紅細(xì)胞酶活性低等。因此，尋找一種安全性高，凍干紅細(xì)胞存活率高、活性高的紅細(xì)胞凍干與復(fù)水工藝，是推廣紅細(xì)胞臨床使用的關(guān)鍵。
02 影響干燥速率的因素
近年來，研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑的存在可以影響溶液的凍結(jié)特性，進(jìn)而可能影響干燥速率和凍干品的外觀。叔丁醇作為有機(jī)溶劑的一種，深受眾多研究者關(guān)注，但是它對(duì)紅細(xì)胞冷凍干燥過程的影響如何，對(duì)紅細(xì)胞回收率是否有影響也從未見報(bào)導(dǎo)過。專家指出，滲透性保護(hù)劑與非滲透性保護(hù)劑的聯(lián)合使用能達(dá)到較好的冷凍前脫水目的。采用40%滲透性保護(hù)劑甘油對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，再加入非滲透性凍干保護(hù)劑進(jìn)行凍干的方法來研究滲透性保護(hù)劑預(yù)處理對(duì)紅細(xì)胞凍干效果的影響。采用無損的微CT掃描技術(shù)，對(duì)正在升華過程的紅細(xì)胞樣品進(jìn)行掃描觀察，以期探索叔丁醇對(duì)干燥過程的影響。通過對(duì)凍干紅細(xì)胞樣品進(jìn)行CT掃描，計(jì)算得到孔隙率，判斷甘油對(duì)紅細(xì)胞體積的影響，認(rèn)識(shí)叔丁醇濃度對(duì)冰晶大小的影響。利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行凍干前后細(xì)胞計(jì)數(shù)，得到甘油和叔丁醇的共同作用情況。
在紅細(xì)胞冷凍干燥過程中，利用微CT掃描技術(shù)進(jìn)行樣品升華干燥過程的定時(shí)掃描觀察，并對(duì)凍干品進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)掃描分析，同時(shí)計(jì)算得到各個(gè)樣品的孔隙率值。對(duì)凍干后的樣品，采用三步法復(fù)水，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)溶劑叔丁醇可以加速凍干過程，縮短干燥時(shí)間，并且濃度為10%的比5%的顯著。在升華過程中，孔隙率呈下降的趨勢(shì)。最高的孔隙率出現(xiàn)在含有10%叔丁醇的經(jīng)甘油預(yù)處理的保護(hù)劑配方中。經(jīng)過甘油預(yù)處理，細(xì)胞的恢復(fù)率得到了明顯的提高，而叔丁醇的加入，導(dǎo)致一定程度上的恢復(fù)率下降。
03 凍干設(shè)備推薦
富睿捷原位凍干機(jī)Mercury系列0.1㎡、0.3㎡機(jī)型，不僅可以做凍干處理，還能真正實(shí)現(xiàn)整個(gè)凍干過程可控，使得樣品凍干效率更高，能耗更低，凍干的品質(zhì)更佳，樣品結(jié)果均一性高，凍干工藝的重復(fù)性好。另外，還可以實(shí)現(xiàn)凍干工藝的摸索，優(yōu)化，放大工藝，共晶點(diǎn)測(cè)試等。制冷系統(tǒng)采用自主研發(fā)混合制冷技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)溫度更低，穩(wěn)定性更好。不銹鋼冷阱的冷凝溫度達(dá)-80°C左右，凍干倉真空度可達(dá) 0.2Pa。紅細(xì)胞樣品凍結(jié)至-50°C左右，保持1h后開始抽真空，一次干燥擱板溫度為-30°C，持續(xù)30h；二次干燥溫度為10°C，持續(xù)10h，真空度低于10Pa。
原位凍干機(jī)優(yōu)勢(shì)：
內(nèi)置直立式不銹鋼冷阱盤管，能夠捕獲樣品凍干過程中升華的水汽，使得凍干倉里的水汽更少，避免水汽在凍干倉內(nèi)形成內(nèi)循環(huán)，讓倉體內(nèi)的水汽液化成液滴附著在樣品，整個(gè)過程是放熱反應(yīng)，如若處理不當(dāng)會(huì)造成有些樣品融化、變質(zhì)或坍塌等；
標(biāo)配高精度皮拉尼真空計(jì)，保證真空度的準(zhǔn)確性，能夠更好的完成凍干實(shí)驗(yàn)，最終實(shí)現(xiàn)品質(zhì)、效率，能耗的平衡；
標(biāo)配凍干終點(diǎn)判定系統(tǒng)，系統(tǒng)可以提醒用戶樣品是否凍干完成，十分便利，避免采樣檢測(cè)，外掛檢測(cè)等，讓整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程省時(shí)，省心，省力。
預(yù)凍溫度可達(dá)-80℃，可充分保證樣品凍結(jié)狀態(tài)，做好樣品的預(yù)凍處理，也保證了諸如一些低共晶點(diǎn)樣品不會(huì)因?yàn)闇囟炔粔蚨诨蝾A(yù)凍不結(jié)實(shí)等問題。
隔板溫度范圍-55℃到55℃；更大的溫度調(diào)控范圍，為凍干曲線摸索和優(yōu)化，工藝放大提供便利條件，提供更大范圍的凍干過程的隔板溫度調(diào)控，實(shí)現(xiàn)凍干效率的提升，包括探尋最佳的凍干曲線等。
隔板的溫差為±1℃，能夠保證均一性，合格率更高。
微CT技術(shù)可以無損的對(duì)物料內(nèi)部進(jìn)行檢測(cè)，通過把微CT掃描技術(shù)引入到紅細(xì)胞冷凍干燥中，進(jìn)行干燥過程的定時(shí)掃描觀察，并對(duì)凍干品進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)重構(gòu)分析，得到結(jié)論為有機(jī)溶劑叔丁醇可以加速凍干過程，縮短干燥時(shí)間，10%濃度的叔丁醇效果比5%的顯著很多；在升華過程中，孔隙率呈下降的趨勢(shì)，因?yàn)橛墒宥〈夹纬傻尼槧畋Ш透视皖A(yù)處理所導(dǎo)致的細(xì)胞體積增大，最高的孔隙率出現(xiàn)在含有10%叔丁醇的經(jīng)甘油預(yù)處理的保護(hù)劑配方中，經(jīng)過甘油預(yù)處理，細(xì)胞的恢復(fù)率得到了顯著的提高，而加入叔丁醇，細(xì)胞的恢復(fù)率又顯著下降。由于叔丁醇升華過程留下了管狀通道含10%叔丁醇的保護(hù)劑配方可以更好的保持細(xì)胞的完整性。
04 總結(jié)
總之，把叔丁醇引入到紅細(xì)胞的冷凍干燥中是否恰當(dāng)，以減少細(xì)胞恢復(fù)率為代價(jià)的縮短凍干時(shí)間是否值得，還有待深入研究。此外，在藥品的冷凍干燥過程中，如果干燥時(shí)間過長(zhǎng)，則藥性或者其作用成分將會(huì)受到影響，故而加快干燥過程的進(jìn)行很有必要，如果能把叔丁醇引入到藥品的凍干生產(chǎn)上，將會(huì)產(chǎn)生十分可觀的效益。
富睿捷致力于服務(wù)各個(gè)有冷凍干燥需求的領(lǐng)域，專業(yè)售前人員根據(jù)您的樣品需求提供一站式的凍干解決方案，讓您全身心投入到實(shí)驗(yàn)研究中，免除后顧之憂。同時(shí)，富睿捷也可提供免費(fèi)做樣服務(wù)，如有凍干需求，可聯(lián)系我們。
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