圖一、pH輔助LNP噴霧干燥示意圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 粉末制備與表征：

本研究采用pH調(diào)節(jié)的SFD技術(shù)成功制備了mRNA-LNPs吸入性粉末。通過調(diào)節(jié)溶液在SFD過程中的pH值，增強(qiáng)了mRNA與LNPs中可電離脂質(zhì)之間的相互作用，從而保留了封裝結(jié)構(gòu)。制備的粉末呈現(xiàn)出適合吸入的特性，mRNA在SFD后仍然被封裝在LNPs內(nèi)。

表二、噴霧干燥后LNP重新水花后的理化性質(zhì)表征

2.2 理化性質(zhì)分析：

• 粒徑與電位：使用ZetaSizer Nano對重新水合的mRNA-LNPs進(jìn)行粒徑測定，結(jié)果顯示，盡管SFD后mRNA-LNPs的粒徑有所增加，但仍在可接受的范圍內(nèi)（約100-150nm），且未觀察到明顯聚集。Zeta電位測定也證實(shí)了粉末的穩(wěn)定性。

• 封裝效率與mRNA完整性：通過電泳分析評估了mRNA的完整性，結(jié)果顯示，在pH 3和5條件下進(jìn)行SFD時，大部分mRNA仍然保留在LNPs內(nèi)部，且mRNA未發(fā)生降解。同時，測定了mRNA的封裝效率，發(fā)現(xiàn)pH調(diào)節(jié)后的SFD方法提高了封裝效率。

• 形態(tài)觀察：使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察了原始液態(tài)和粉末狀mRNA-LNPs的形態(tài)，結(jié)果顯示，粉末狀mRNA-LNPs在重新水合后保持了良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

  
  

  
  

圖二、噴霧干燥后LNP的表征

圖三、噴霧干燥后LNP重新水化的形態(tài)表征

2.3 生物活性評估

• 細(xì)胞表達(dá)活性：將制備的粉末狀mRNA-LNPs分散在培養(yǎng)基中，并添加到A549和RPMI 2650細(xì)胞中，評估其蛋白表達(dá)活性。結(jié)果顯示，在pH 5條件下制備的粉末狀mRNA-LNPs在兩種細(xì)胞中均表現(xiàn)出最高的Luc（熒光素酶）表達(dá)水平。此外，ZsGreen1（一種綠色熒光蛋白）的表達(dá)也呈現(xiàn)出類似的趨勢。

• 細(xì)胞內(nèi)分布與攝取：使用流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLMS）評估了粉末狀mRNA-LNPs在細(xì)胞內(nèi)的分布和攝取情況。結(jié)果顯示，盡管在pH 5條件下制備的粉末狀mRNA-LNPs的細(xì)胞內(nèi)攝取量不是最高的，但其蛋白表達(dá)水平卻是最高的。這表明，pH調(diào)節(jié)可能增強(qiáng)了mRNA向LNPs的封裝效率，而不是直接促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)攝取。

• 長期儲存穩(wěn)定性：評估了粉末狀mRNA-LNPs在長期儲存后的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在pH 5條件下制備的粉末狀mRNA-LNPs在儲存105天后仍然保持了較高的蛋白表達(dá)水平，而未進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的粉末狀mRNA-LNPs在儲存105天后蛋白表達(dá)水平幾乎無法檢測到。此外，與原始液態(tài)mRNA-LNPs相比，粉末狀mRNA-LNPs在儲存62天后表現(xiàn)出更高的mRNA轉(zhuǎn)染效率。

• 氣管內(nèi)給藥效果：將粉末狀和液態(tài)mRNA-LNPs氣管內(nèi)給予小鼠，并評估了其在肺部的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與液態(tài)mRNA-LNPs相比，粉末狀mRNA-LNPs在小鼠肺部表現(xiàn)出較低的蛋白表達(dá)水平，但仍然具有顯著的生物活性。這表明，粉末狀mRNA-LNPs可能適用于吸入性給藥。
  

圖五、噴霧干燥后LNP的體外表達(dá)表征

圖六、噴霧干燥后LNP的穩(wěn)定性表征

結(jié)論

參考文獻(xiàn)：Ogawa, Koki, et al. "Stable and inhalable powder formulation of mRNA-LNPs using pH-modified spray-freeze drying." International Journal of Pharmaceutics 665 (2024): 124632.