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這些超濾離心管的使用問題你都遇到過嗎?

閱讀:1029        發(fā)布時(shí)間:2021-8-16

近做實(shí)驗(yàn)不順利,經(jīng)常得不到目標(biāo)蛋白,要么就是蛋白損失很大。怎么辦呢?

由于超濾管使用不恰當(dāng)或是超濾知識(shí)缺乏引起的問題,簡直成了實(shí)驗(yàn)汪們蛋白實(shí)驗(yàn)不成功、效率低下的常見原因之一。比如說:

_

為什么我截留分子量選擇沒錯(cuò),蛋白有時(shí)候卻會(huì)漏出在濾出液中?

_

為什么我用濃縮后的蛋白做下游分析的時(shí)候發(fā)現(xiàn)有干擾?

_

用超濾管來分離兩種蛋白可以嗎?

_

有時(shí)候我用超濾離心管連水都離不下來,可能的原因是?

_

超濾管可以用來脫鹽和濃縮核酸嗎?

_

如何給超濾管滅菌?

 

于是,膜過濾和超濾專家專門寫了一篇攻略,幫助實(shí)驗(yàn)小白們成功在通往技術(shù)大牛的道路上打怪升級(jí)。

廢話不多說,上干貨,小板凳搬好了哦!

我們先來看看重點(diǎn)問題怎么解決

Q

為什么我截留分子量選擇沒錯(cuò),
蛋白有時(shí)候卻會(huì)漏出在濾出液中?

A

導(dǎo)致漏蛋白甚至檢測不到蛋白的原因很復(fù)雜,應(yīng)優(yōu)先根據(jù)樣品調(diào)整工藝,因?yàn)橥环N膜、截留分子量和裝置組合對(duì)于不同的蛋白質(zhì)類別甚至物種而言可能并非優(yōu)之選。

在選擇過程中,應(yīng)先執(zhí)行以下步驟:

1

考慮樣品和分子特性:比如改變pH 可能增加構(gòu)象改變的風(fēng)險(xiǎn),而降低溫度可能降低濃縮效率等。

2

選擇正確的膜:超濾沒有太多的膜選項(xiàng),但您應(yīng)對(duì)再生纖維素(RC)、Hydrosart® 和聚醚砜(PES)材料進(jìn)行測試,以確定哪種材料可為您的特定材料提供較低的非特異性結(jié)合和優(yōu)的回收率。

3

選擇合適的截留分子量,通常是靶標(biāo)1/3大小的截留分子量比較適合。但有時(shí)則需要更小的孔徑來滿足回收率的要求。如果在病毒和核酸樣品,可參看下面截留分子量和病毒顆粒分子大小以及核酸大小的換算表。

4

選擇合適的裝置:賽多利斯擁有適用于低濃度樣品、DNA、蛋白質(zhì)、病毒、過濾應(yīng)用等廣泛的裝置選項(xiàng);選擇合適的裝置可以有效改善結(jié)果。

5

使用合適的裝置處理方法:例如預(yù)沖洗以去除分析物或用非干擾蛋白沖洗以鈍化結(jié)合位點(diǎn)并減少損失。

6

考慮樣品控制方法,例如使用裝置內(nèi)的“死體積”移走所有截留物,或預(yù)灌裝濾液管以控制截留物的終體積。

 

Q

為什么我用濃縮后的蛋白
做下游分析的時(shí)候發(fā)現(xiàn)有干擾?

A

超過濾薄膜含有微量甘油。如果此材料干擾分析,可用緩沖液或去離子水預(yù)清洗。如果干擾仍然存在,用 0.1 N NaOH 清洗,然后用緩沖液或去離子水再次清洗后甩干。如果必須用NaOH處理的時(shí)候,推薦試用聚醚砜(PES)膜,因?yàn)楸龋ㄔ偕w維素)RC膜更耐NaOH,同時(shí)提醒NaOH不能過夜浸泡。

Q

用超濾管來分離兩種蛋白可以嗎?

A

因?yàn)槌瑸V膜的孔徑不是規(guī)則的結(jié)構(gòu),所以不能進(jìn)行精確的分離,所以按照經(jīng)驗(yàn),我們推薦兩個(gè)蛋白的分子量要相差一個(gè)數(shù)量級(jí)(10倍)以上才可以進(jìn)行分離。另外,賽多利斯的300k,1000k和0.2um的超濾管可以實(shí)現(xiàn)10倍以上分子量差異的蛋白粗分離。

 

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