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LeapWal-PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑
  • LeapWal-PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑
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貨物所在地:湖南長沙市

更新時間:2024-10-18 21:00:07

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LeapWal PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑 P09410是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑,適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染,對多種常見細(xì)胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率,具有高效低毒、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點,適用siRNA/miRNA介導(dǎo)的基因抑制實驗。



PolyShooter INTERFERE Transfection Reagent

For the transfection of siRNA/miRNA into animal cells

CatalogNumber:P09410


01/產(chǎn)品概述


  RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域最為重大的發(fā)現(xiàn)之一,它是指小分子雙鏈RNA可以特異性地降解同源mRNA,從而抑制或關(guān)閉特定基因表達的現(xiàn)象。人們只要知道了某種疾病的致病基因,就可以設(shè)計出針對該基因mRNA的小分子干擾RNA(SmallinterferingRNA,siRNA),抑制或封閉該致病基因的表達,從而達到治療疾病的目的。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達,所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤等基因治療領(lǐng)域。RNAi是目前最為熱門的生命科學(xué)研究領(lǐng)域,也是未來最有發(fā)展前途的新藥開發(fā)領(lǐng)域。除此之外,RNAi技術(shù)還可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)和漁業(yè)等多種領(lǐng)域,進行良種培育、良種篩選和疾病治療等。

   siRNA/miRNA導(dǎo)入有以下幾種方法∶化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術(shù)、顯微注射和載體導(dǎo)入技術(shù)。由于電轉(zhuǎn)的方法對細(xì)胞損傷比較大,一般不建議選擇電轉(zhuǎn)?;瘜W(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)是目前最為常用的方法,化學(xué)轉(zhuǎn)染能否成功的關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)染試劑的選擇。

   PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑 P09410,即PolyShooter INTERFERE Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑,適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染。其原理為帶正電的高分子聚合物與siRNA/miRNA帶負(fù)電的磷酸基團形成帶正電的復(fù)合物后,與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用,并通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞,形成內(nèi)含體。該轉(zhuǎn)染試劑具有質(zhì)子海綿的作用,能夠吸收溶酶體中的H+,質(zhì)子的不斷流入導(dǎo)致復(fù)合體腫脹破裂,從而使外源siRNA或miRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中,實現(xiàn)siRNA/miRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

  PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑 P09410 對多種常見細(xì)胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率,具有高效低毒、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點,適用siRNA/miRNA介導(dǎo)的基因抑制實驗。其*的配方使其轉(zhuǎn)染后無明顯細(xì)胞毒性,因此無需去除轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基,也可根據(jù)具體情況優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系。



02/產(chǎn)品組分


組分

P09410-01

P09410-05

PolyShooter INTERFERE

Transfection Reagent

1 mL/

1 mL x 5



03/保存條件


冰袋(wetice)運輸。4℃保存,有效期6個月。-30℃至-10℃保存,有效期12個月,避免反復(fù)凍融。



04/產(chǎn)品特點


  轉(zhuǎn)染效率高——針對廣泛類型的細(xì)胞,均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率,基因抑制效果好,脫靶效應(yīng)低

  細(xì)胞毒性低——作用溫和,能較好地實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細(xì)胞毒性之間的平衡

  適用范圍廣——可用于多種細(xì)胞類型,適合siRNA/miRNA介導(dǎo)的基因抑制實驗

  操作簡單——簡單快速的實驗方案,可獲得穩(wěn)定的結(jié)果,且轉(zhuǎn)染后無需去除復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基



05/適用范圍


  LeapWal PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑,適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染。



06/實驗流程概要

09410.png



07/實驗步驟(以24孔板為例,其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一:轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn))


1: 準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染細(xì)胞

貼壁細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前一天,將胰~酶消化后的細(xì)胞按照每孔0.1-1x105個細(xì)胞的量進行鋪板,使其在轉(zhuǎn)染時密度為30%-40%。

懸浮細(xì)胞:轉(zhuǎn)染當(dāng)天,配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前,在24孔板中進行細(xì)胞鋪板,每500 µL生長培養(yǎng)基中加入0.5-2.5x105個細(xì)胞。

? 細(xì)胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率,待轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài),建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。


2: 準(zhǔn)備PolyShooterTM INTERFERE轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物

(1)取1 μL siRNA (20 μM,DEPC水溶解) 加入到1.5 mL離心管中,加入2 μL PolyShooterTM INTERFERE轉(zhuǎn)染試劑與siRNA混合,室溫孵育3分鐘。

? 基因性質(zhì)、細(xì)胞類型、siRNA效價、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周轉(zhuǎn)率等因素均會影響siRNA的轉(zhuǎn)染效率,建議選取siRNA作用濃度在10-100 nM之間,轉(zhuǎn)染試劑的體積應(yīng)根據(jù)siRNA濃度和培養(yǎng)皿的大小進行調(diào)整,請參見表一。

(2)往上述混合物中加入100 μL Opti-MEMTM I減血清培養(yǎng)基(無血清無雙抗),輕輕混勻,在室溫下靜置30分鐘,形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。


3: siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染

30分鐘后,將上述100 µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞,輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。


4. 分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因干擾效率

轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時后,可根據(jù)實際情況用RT-PCR、Western Blot、ELISA、熒光檢測法、流式細(xì)胞術(shù)、報告基因等檢測基因干擾效果,或進行后續(xù)功能實驗。

? 該轉(zhuǎn)染試劑也適合轉(zhuǎn)染miRNA,具體操作請參考siRNA的操作流程。



表一:轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞培養(yǎng)裝置

生長培養(yǎng)基體積

mL)

siRNA20μM

μL)

轉(zhuǎn)染試劑(μL)

Opti-MEMTM I

減血清培養(yǎng)基體積        μL)

96孔板

0.1

0.2

0.4

20

24孔板

0.5

1

2

100

12孔板

1

2

4

200

6孔板

2

4

8

400

60 mm培養(yǎng)皿

4

8

16

800

100 mm培養(yǎng)皿

10

20

40

2000



08/注意事項


1.核酸質(zhì)量:確保siRNA/miRNA是經(jīng)過PAGE純化和脫鹽處理的,高純度的siRNA/miRNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

2.細(xì)胞質(zhì)量:細(xì)胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率,建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。

3.細(xì)胞密度:建議細(xì)胞傳代后12-24h內(nèi)、細(xì)胞密度為30%-40%時進行轉(zhuǎn)染。不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗,對細(xì)胞密度的要求不盡相同。在進行不同核酸或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時,需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實驗條件。此外,在實驗過程中保證相同的接種條件,確保實驗數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。

4. siRNA與轉(zhuǎn)染試劑使用比例對于大多數(shù)細(xì)胞系而言,轉(zhuǎn)染復(fù)合物中siRNA (μL of 20 μM Stock)PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent (μL) 的比例在111:3之間,推薦比例為1:2。想要獲得理想的基因干擾結(jié)果,需要對這一比例進行優(yōu)化,根據(jù)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞及siRNA選擇適合的轉(zhuǎn)染比例。

5. 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent的相容性

6. 轉(zhuǎn)染前,確保siRNA/miRNA基因沉默表達不會影響細(xì)胞活力。

7. 您需要設(shè)計針對目的基因的若干siRNA(小干擾RNA)并評估其效價。

8. 整個實驗過程使用無RNA酶和無熱原性的材料,如離心管、槍頭、緩沖液。

9. 為了您的健康安全,請規(guī)范操作,穿戴實驗服手套開展實驗

10. 本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及治療。




09/實驗案例分析

 

1: 轉(zhuǎn)染前一天,將穩(wěn)定表達GFP的HeLa細(xì)胞接種于24孔板,使其在轉(zhuǎn)染時密度為30%。

2: 按照每孔計量,取1μL siRNA(GFP/NC, 20 μM)加入到1.5 mL離心管中,再加入2 μL PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent與siRNA進行混合,室溫孵育3 min。

3: 往上述混合物中加入100 μL Opti-MEMTM I減血清培養(yǎng)基(不含血清不含雙抗),輕輕混勻,在室溫條件下靜置30 min,形成PolyShooterTM INTERFERE轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

4: 30分鐘后,將上述100 µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞,輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

5: siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時后,用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測GFP綠色熒光蛋白干擾效果,實驗結(jié)果如圖2所示。

6: 說明:此次實驗選擇商業(yè)化的 siRNA轉(zhuǎn)染試劑RNAiMAX作為對照組,RNAiMAX的具體實驗操作按照其說明書進行。簡單來說:在不含抗生素的50 μL 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋1μL siRNA(GFP, 20 μM),輕輕混勻。然后,在不含抗生素的50 μL 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋1μL RNAiMAX,輕輕混勻。將稀釋的siRNA與稀釋的RNAiMAX輕輕混合,在室溫下孵育20分鐘。將混合物添加到細(xì)胞中,其終體積為600μL。siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時后,用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測GFP綠色熒光蛋白干擾效果。


截屏2022-07-11 00.19.42的副本.png

圖2: siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后,熒光顯微鏡(A)及流式細(xì)胞儀(B)檢測GFP干擾效果


10/其他相關(guān)產(chǎn)品


產(chǎn)品名稱

貨號

規(guī)格

PolyShooterTM

Transfection Reagent

P09110-01

1 mL

P09110-05

1 mL x 5

PolyShooterTM NEO-PEI

Transfection Reagent

P09310-01

1 mL

P09310-100

100 mL

P09310-500

500 mL

PolyShooterTM Protein

Transfection Reagent

P19103-01

0.3 mL

P19103-05

0.3 mL x 5





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