銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin，Cp)測定試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
銅藍(lán)蛋白是血漿的含銅蛋白，有運(yùn)輸銅的功能，同時(shí)具有氧化酶的活性，是細(xì)胞外液重要的抗氧化劑。
測定原理:
銅藍(lán)蛋白催化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺生成藍(lán)色產(chǎn)物，在645nm處有特征吸收峰，依此可得銅藍(lán)蛋白活性。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體7mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。（使用前37℃預(yù)熱）
樣本前處理：
1、 血清（漿）等液體樣本：直接檢測。
2、 動植物組織樣本：稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水，進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定操作表:
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至645nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 操作表
空白管 | 測定管 | |
樣品（µL） | 30 | 30 |
試劑一（µL） | 90 | 90 |
試劑二（µL） | 60 | |
混勻，37℃預(yù)熱5min | ||
試劑三（µL） | 120 | 120 |
混勻，37℃反應(yīng)30min | ||
試劑二（µL） | 60 | |
混勻，25℃室溫放置5min，取200µL于微量石英比色皿/96孔板中，測定645nm處吸光值。 ΔA=A測定-A空白。 | ||
計(jì)算公式:
a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1.按體積計(jì)算
酶活定義:37℃條件下， 每分鐘每毫升樣品與底物作用吸光度升高0.01為一個(gè)酶活單位。
Cp活力（U/mL）=ΔA×V反總÷0.01÷V樣÷T = 33.33×ΔA
2.按鮮重計(jì)算
單位定義：37℃條件下，每分鐘每克樣品與底物作用吸光值升高0.01為一個(gè)酶活單位。
Cp活力（U/g鮮重）=ΔA×V反總÷0.01÷（W×V樣÷V樣總）÷T = 33.33×ΔA÷W
3.按蛋白濃度計(jì)算
單位定義：37℃條件下，每分鐘每毫克蛋白樣品與底物作用吸光值升高0.01為一個(gè)酶活單位。
Cp活力（U/ mg prot）=ΔA×V反總÷0.01÷（Cpr×V樣）÷T = 33.33×ΔA÷Cpr
V樣：0.03 mL；V反總：0.3 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；V樣總：加入提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g
b. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1、 按體積計(jì)算
酶活定義:37℃條件下， 每分鐘每毫升樣品與底物作用吸光度升高0.005為一個(gè)酶活單位。
Cp活力（U/mL）=ΔA×V反總÷0.005÷V樣÷T = 66.66×ΔA
2、 按鮮重計(jì)算
單位定義：37℃條件下，每分鐘每克樣品與底物作用吸光值升高0.005為一個(gè)酶活單位。
Cp活力（U/g鮮重）=ΔA×V反總÷0.005÷（W×V樣÷V樣總）÷T = 66.66×ΔA÷W
3、 按蛋白濃度計(jì)算
單位定義：37℃條件下，每分鐘每毫克蛋白樣品與底物作用吸光值升高0.005為一個(gè)酶活單位。
Cp活力（U/ mg prot）=ΔA×V反總÷0.005÷（Cpr×V樣）÷T = 66.66×ΔA÷Cpr
V樣：0.03 mL；V反總：0.3 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；V樣總：加入提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g
注意事項(xiàng):
試劑二和試劑三有一定的毒性和刺激性，請操作時(shí)做好防護(hù)措施。
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優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
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