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鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)說明書

閱讀:472      發(fā)布時間:2024-10-12
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【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name :Duck Plague Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

鴨瘟,又稱鴨病毒性腸炎,是由皰疹病毒科鴨瘟病毒(Duck Plague Virus, DPV) 引起的一種急性(有時呈慢性)鴨、鵝和天鵝接觸性傳染病。其特征為體溫升高,兩腿麻痹,下痢,流淚和部分病鴨頭頸腫大。食道粘膜有小出血點,并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍,泄殖腔粘膜充血出血水腫和假膜覆蓋。肝有不規(guī)則大小不等的出血點和壞死灶[1]。本病傳播迅速,發(fā)病率和死亡率高,嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展。

本試劑盒適用于檢測病鴨血液、口腔偽膜及潰瘍處粘液、肝、脾、腎等組織樣品   等樣本中的鴨瘟病毒,用于鴨瘟病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒對鴨瘟病毒基因組保守區(qū)設計特異性引物和探針[1-3],用熒光 PCR 技術對鴨瘟病毒的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

規(guī)

酶液50μL×1 管

DPV 反應液500μL×2 管

DPV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

注:

1)不同批號試劑不能混用。

2)試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列

熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

在發(fā)病早期,無菌采集病鴨血液或刮取口腔偽膜及潰瘍處粘液;在動物死亡后,

無菌采取肝、脾、腎等組織樣品

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本

運送應采用 2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1樣本前處理

組織樣品:每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術剪剪碎混勻后取0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;粘液直接取 100μL 提取

1.2DNA 提取

推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒(離心柱提取

法),請按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制(試劑準備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:

試劑DPV 反應液酶液

用量(樣本數(shù)為 N)20μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,21uL/管。

3.加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4.PCR 擴增(核酸擴增區(qū))

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi);

4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye) NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置:

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃10min

240 cycles94℃15sec

55℃30sec

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;

可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38, 且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性;

陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;

陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

?樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關;

?樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

?陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導致假陽性結(jié)果;

?病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結(jié)果;

?不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結(jié)果;

?試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定   量檢測不準確的結(jié)果;

?本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。


【注意事項】

?所有操作嚴格按照說明書進行;

?試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,完-全混勻并短暫離心;

?反應液應避光保存;

?反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

?使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

?樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;

?實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

?試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通   則》進行處理。

【參考文獻】

[1]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. SN/T-2744-2010 鴨病毒性腸炎檢疫技術規(guī)范[S]. 北京: 科學出版社, 2010.

[2]索化夷, 湯承, 岳華, 等. 實時熒光定量TaqMan-PCR 檢測鴨瘟病毒方法的建立[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2006.

[3]馬騰飛. 鴨瘟病毒熒光定量 PCR 檢測方法的建立及其強弱毒株 UL2 基因差異分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學, 2015.


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