【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：豬肺炎支原體（MHP）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name：Mycoplasma hyopneumoniae Detection Kit（Real-Time PCR Method）
【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒
【預期用途】
豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae, MHP）可引起豬支原體肺炎，該病又稱豬霉形體肺炎或豬氣喘病，是豬的一種高發(fā)性的慢性呼吸道傳染病，主要臨床表現(xiàn)為咳嗽和氣喘，病理變化以患豬肺心葉、尖葉的背側和橫隔葉的前端肉樣病變?yōu)樘卣鱗1]。該病一年四季均可發(fā)病，但以冬、春寒冷季節(jié)較常見，各種日齡豬均可發(fā)病。 病豬生長緩慢，飼料利用率低，給世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。
本試劑盒適用于檢測氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的豬肺炎支原體，用于豬肺炎支原體感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒對豬肺炎支原體基因保守區(qū)設計特異性的引物和探針[2-3]，用熒光 PCR 技術對豬肺炎支原體的DNA
進行體外擴增檢測，用于對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規(guī)格25T/盒50T/盒
MHP 反應液500μL×1 管500μL×2 管
酶液25μL×1 管50μL×1 管
MHP 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺豬，無菌采集肺病變部位或病變/非病變部位交界處的樣品；生豬滅菌棉拭子沾取氣管分泌物， 放入無菌試管中
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入
1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL
滅菌離心管中；棉拭子取 100μL 進行提取。
1.2 核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取， 請按照試劑說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：
試劑MHP 反應液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇
ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及 Threshold的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；
可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6.質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7.檢測方法的局限性
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；
3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；
7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]李瑩瑩,何穎, 趙武, 等。豬支原體肺炎研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展, 2013,34（10）: 95-100
[2]張旭, 白方方, 武昱孜, 等. PCR 技術檢測豬支原體肺炎的研究進展[J]. 生物技術通報, 2012（5）: 54-60.
[3]Dubosson C R, Conzelmann C, Miserez R, et al. Development of two real-time PCR assays for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in clinical samples [J]. Veterinary microbiology, 2004, 11: 55-65.
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