巴貝斯蟲(chóng)（Bab）核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

通用名稱：巴貝斯蟲(chóng)（Bab）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Babesia Canis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

巴貝斯蟲(chóng)病是一種蜱傳性的血液原蟲(chóng)病，該病由寄生于紅細(xì)胞內(nèi)的多種巴貝斯蟲(chóng)引起，其臨床特征為發(fā)熱、精神沉郁、嗜睡、黃疸、貧血、血紅蛋白尿、嘔吐、呼吸困難等，對(duì)犬的健康造成了巨大的危害。[1-2]

本試劑盒適用于檢測(cè)血液中的巴貝斯蟲(chóng)，用于巴貝斯蟲(chóng)感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)巴貝斯蟲(chóng)基因組特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)巴貝斯蟲(chóng)基因組的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

無(wú)菌注射器抽取血液 3~5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入

1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；咽拭子樣品直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2 核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請(qǐng)按    照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿

10 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的

Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；

可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線， 判定為陽(yáng)性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。

6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7. 檢測(cè)方法的局限性

1. 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2. 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

3. 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

4. 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7. 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

1. 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 李蓓蓓.犬巴貝斯蟲(chóng)病的診斷與預(yù)防[J].今日畜牧獸醫(yī),2019,35(03):99.

[2] 陜西省部分寵物醫(yī)院犬巴貝斯蟲(chóng)病流行情況及病原鑒定[D]. 唐歡.西北農(nóng)林科技大學(xué)，2019.

蜱傳性的血液原蟲(chóng)病，該病由寄生于紅細(xì)胞內(nèi)的多種巴貝斯蟲(chóng)引起，其臨床特征為發(fā)熱、    精神沉郁、嗜睡、黃疸、貧血、血紅蛋白尿、嘔吐、呼吸困難等，對(duì)犬的健康造成了巨大的危害。[1-2]