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腺病毒包裝實驗

重組腺病毒載體是基于人腺病毒 5 型（Ad5），其基因組是 36kb 長的線性雙鏈 DNA，是一種復制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)。具有以下幾個顯著優(yōu)點：感染范圍廣，幾乎可以感染所有的細胞系、原代細胞和部分組織；感染效率可高達 100%；對外源基因容載能力大（可以高達 8Kb）；不整合基因組；滴度高，操作方便。因此，重組腺病毒是一種最ju有潛力的基因遞送工具。

最chang用的腺病毒包裝體系有 AdEasy 和 AdMAX 兩種，其共同特點是目的基因首先克隆到穿梭載體，再重組到腺病毒的大骨架上。以上兩個系統(tǒng)均具有腺病毒早期轉錄復制基因 E1 和 E3 的缺陷（ΔE1，ΔE3），其中 E3 基因對病毒的產(chǎn)生并非必需。因此，腺病毒包裝必需依賴表達 E1 的細胞系，例如 HEK-293，HEK-293A 等。

一、實驗流程

圖 1、 腺病毒包裝實驗流程圖

二、實驗儀器與材料

表 1、腺病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒

三、實驗步驟 

1. 質(zhì)粒構建和擴增

AdMAX 系統(tǒng)：構建連接目的基因的 pHBAdMAX質(zhì)粒和pBHGlox(delta)E1, 3Cre 質(zhì)粒并大量抽提，用于轉染 293A 細胞。

AdEasy 系統(tǒng)：構建連接目的基因的 pHBAdEasy 質(zhì)粒并進行酶切線性化；線性化后轉入 BJ5183 感受態(tài)（含 pAdEasy-1 骨架質(zhì)粒）進行重組，涂板培養(yǎng)單克隆并擴增，抽提質(zhì)粒進行 PacI 酶切驗證；驗證正確的重組質(zhì)粒轉化 Stbl3 感受態(tài)，得到高純度的重組質(zhì)粒并進行 PacI 酶切線性化，用于轉染 293A 細胞。

2. 腺病毒包裝

表 2、腺病毒包裝轉染體系

3. 腺病毒收集

挑取 3-6 個空斑不等，放入1 ml新鮮培養(yǎng)基中過夜，然后比較滴度，使用滴度最高的一個空斑進行后續(xù)實驗。（注：病毒收集前要觀察病毒空斑是否形成。為了限制病毒的擴散而讓空斑更好地形成，可在培養(yǎng)液中加入低熔點瓊脂糖，一般在轉染后第 10 ~ 21 天可以在顯微鏡下看到小的空斑。）

4. 腺病毒擴增

將培養(yǎng)基中的病毒加入新鮮 293A 細胞培養(yǎng)液中進行病毒少量擴增，至再次出現(xiàn)空斑，收集細胞及上清，反復凍融三次收集病毒（P1 代），感染 293A 細胞，連續(xù)進行三代感染，至 P4 代進行腺病毒的大量擴增并收集病毒。

5. 腺病毒純化

將病毒從 -80 ℃ 冰箱取出，室溫水浴融化。在 4 ℃ 下，7000 g 離心 10 min，棄細胞碎片，收集上清，0.22 μm 過濾除菌即可用于細胞實驗。若用于對腺病毒滴度和純度要求高的動物實驗，則需要采用 PEG8000 沉淀-CsCl 密度梯度離心-透析聯(lián)用法進行純化。

6. 病毒重懸和保存

棄上清，500 μl 重懸液重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于 4 ℃ 保存，如需長時間存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。

四、注意事項

1. 腺病毒相關實驗請在生物安全柜（BL-2 級別）內(nèi)操作。

2. 操作病毒時請穿實驗服，佩戴口罩和手套，盡量不要裸露雙手及手臂的皮膚。

3. 操作病毒時特別小心病毒濺出。如果操作時超凈工作臺有bing毒污染，請立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液請用84消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。

4. 如需要離心，應使用密封性好的離心管，如有必要請用封口膜封口后離心。

5. 動物注射操作請在生物安全柜內(nèi)（BL-2 級別）完成。

6. 病毒相關的廢棄物需要特殊收集，統(tǒng)一經(jīng)高溫滅菌處理。

7. 實驗完畢用洗手液清洗雙手。

五、常見問題

1. 腺病毒載體有幾代，需要怎樣選擇？

第一代腺病毒載體：E1/E3 基因缺失的腺病毒載體稱為第一代腺病毒載體；

第二代腺病毒載體：E2A/E4 基因缺失的腺病毒載體被稱為第二代腺病毒載體，產(chǎn)生的免疫原性較低，載體容量和安全性方面均提高，但病毒包裝難度和出毒滴度嚴重下降，應用受限。

第三代腺病毒載體：第三代載體缺失了全部的或大部分腺病毒基因，僅保留了兩端 ITR 和包裝信號。包裝容量高達 35kb，免疫原性極低，載體中引入核基質(zhì)附著區(qū)基因用于外源基因長期表達并增加了載體的穩(wěn)定性。但第三代載體系統(tǒng)需要腺病毒突變體作為輔助病毒。

目前，第一代腺病毒載體仍是科研和臨床應用最為廣泛的腺病毒載體，因此更為推薦。

2. 腺病毒的兩種包裝系統(tǒng)怎么選擇？

需要根據(jù)自己實驗室的經(jīng)驗以及需求進行選擇。

（1）AdEasy 系統(tǒng)：操作步驟相對可控，AdEasy 系統(tǒng)得到的病毒滴度相對較高。AdEasy 系統(tǒng)是較常用的系統(tǒng)，在 BJ5183 感受態(tài)中完成環(huán)狀腺病毒基因組的重組，將重組腺病毒基因組經(jīng) Pac I 酶切線性化后轉染 293A 細胞。但重組腺病毒基因組的陽性率比較低，需要挑選大量的克隆進行驗證。

（2）AdMax 系統(tǒng)：是直接將穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒導入到包裝細胞 293A 中，重組過程不可控，中間無法進行篩選，所以重組假陽性較高，篩選陽性結果的難度較 AdEasy 系統(tǒng)高很多。 但 AdMax 包裝系統(tǒng)流程更簡便易操作，適合新手研究人員。

3. 腺病毒純化的目的是什么？

純化后的腺病毒可以去除缺損的病毒顆粒、細胞毒素、細胞培養(yǎng)基、以及細胞碎片等雜質(zhì)。純化腺病毒免疫原性較低，更適合做動物實驗。

4. 腺病毒感染毒斑和細胞聚集怎么進行區(qū)分？

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)類似病毒空斑或者細胞聚集的現(xiàn)象時，應繼續(xù)培養(yǎng) 1-3 天，觀察聚集區(qū)域是否擴散，若持續(xù)擴散一般為病毒毒斑，若聚集區(qū)域保持不變，則一般為細胞聚集現(xiàn)象。

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