NEB-Q5定點(diǎn)突變試劑盒(不含感受態(tài)細(xì)胞)可以在 2 小時(shí)內(nèi)快速對雙鏈質(zhì)粒DNA進(jìn)行定點(diǎn)突變。該試劑盒使用穩(wěn)定的Q5熱啟動超保真 DNA 聚合酶,結(jié)合客戶自行設(shè)計(jì)的引物,在各種質(zhì)粒中引入插入、缺失和替換突變。PCR 后將擴(kuò)增材料直接添加到du特的激酶-連接酶-DpnI(KLD)酶混合液中,進(jìn)行快速室溫環(huán)化和模板去除(5 分鐘)。操作方便、簡單,只需一天時(shí)間便可完成整個(gè)操作,并且不受載體、宿主菌的限制。
操作使用:
步驟 I:指數(shù)擴(kuò)增 (PCR)
1. 將以下試劑組裝在薄壁PCR管中。
2. 將試劑wan全混合,然后轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀中。
3. 執(zhí)行以下循環(huán)條件: 常規(guī)PCR的熱循環(huán)條件:
* 有關(guān)誘變引物的 Q5 優(yōu)化退火溫度,請使用在線 NEB 引物設(shè)計(jì)軟件 NEBaseChanger™。對于預(yù)先設(shè)計(jì)的背靠背引物組,可以應(yīng)用 Ta = Tm + 3 規(guī)則,但可能需要進(jìn)行優(yōu)化。
注意:我們建議通過在瓊脂糖凝膠上觀察 2–5 μl 反應(yīng)來確保 PCR 產(chǎn)物干凈。
第二步:激酶、連接酶和DpnI(KLD)處理
1. 組裝以下試劑:
2. 上下移液充分混合,在室溫下孵育 5 分鐘。
第三步:轉(zhuǎn)型
1.在冰上解凍50μl化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞[NEB 5-α感受態(tài)大腸桿菌(高效),NEB #C2987]。
2.將步驟II中的5μlKLD混合物加入解凍的細(xì)胞管中。小心地輕彈管子 4-5 次以混合。不要渦旋。
3. 將混合物放在冰上 30 分鐘。
4.在42°C下熱休克30秒。
5. 放在冰上 5 分鐘。
6. 將 950 μl 室溫 SOC 移液到混合物中。
7. 在 37°C 下振蕩 (250 rpm) 孵育 60 分鐘。
8. 通過輕彈試管和倒置徹di混合細(xì)胞,然后將 50-100 μl 鋪展到選擇板上,并在 37°C 下孵育過夜。 可能需要(特別是對于簡單的替換和刪除實(shí)驗(yàn))在鋪板之前將 SOC 中的轉(zhuǎn)化混合物稀釋 10 到 40 倍,以避免菌落的草坪
產(chǎn)品選購:
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
E0552S | 定點(diǎn)突變試劑盒(不含感受態(tài)細(xì)胞) | 10 reactions |
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