碧云天 LipoInsect轉(zhuǎn)染試劑(C0551-7.5ml)是一種基于陽(yáng)離子脂質(zhì)體等最新轉(zhuǎn)染技術(shù)的非常高效的新型昆蟲(chóng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。本產(chǎn)品轉(zhuǎn)染效率高、操作簡(jiǎn)單、細(xì)胞毒性低、重復(fù)性好，達(dá)到了國(guó)際最主流昆蟲(chóng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效果。
本產(chǎn)品適用于將pFastBac1等桿狀病毒表達(dá)載體質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到Sf9、Sf21和High Five™等昆蟲(chóng)細(xì)胞以用于Bac-to-Bac®、BaculoDirect™和InsectSelect™表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)。LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑操作簡(jiǎn)單，使用方法和常用的Cellfectin® II Reagent完quan一致。LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，通常96小時(shí)后達(dá)到較高的蛋白表達(dá)水平。LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效果可以通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)EGFP等熒光蛋白的bacmid進(jìn)行快速鑒定。
操作使用：
1. Bacmid轉(zhuǎn)染：
a. 昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)：按照每孔約80萬(wàn)Sf9或Sf21細(xì)胞(具體的細(xì)胞數(shù)量據(jù)細(xì)胞類型、大小和細(xì)胞生長(zhǎng)速度等而定)用正常的細(xì)胞培養(yǎng)液接種到六孔板內(nèi)，使細(xì)胞密度能達(dá)到約70-90%。在27-28℃培養(yǎng)，后續(xù)轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)也在該溫度下進(jìn)行。
b. 15分鐘后，將正常的細(xì)胞培養(yǎng)液更換為平板培養(yǎng)液(含1.5%胎牛血清不含抗生素的SFX-INSECT培養(yǎng)液)每孔0.8ml。
c.對(duì)于待轉(zhuǎn)染的六孔板中每一個(gè)孔的細(xì)胞，取兩個(gè)潔凈無(wú)菌離心管，分別加入100μl不含血清和抗生素的SFX-INSECT昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液用于稀釋bacmid和轉(zhuǎn)染試劑。其中一管加入16μg bacmid，并用槍輕輕吹打混勻；另一管加入8μl LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑，用槍輕輕吹打混勻，或者輕微Vortex混勻，但不可離心。稀釋的bacmid和轉(zhuǎn)染試劑室溫靜置約2-5min(最多不得超過(guò)30分鐘)。隨即把稀釋的bacmid用移液器輕輕加入到稀釋的LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑中，輕輕顛倒離心管或者用槍輕輕吹打混勻，室溫靜置15-30分鐘。
d. 按照六孔板每孔200μl LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑-bacmid混合物的用量，均勻滴加到整個(gè)孔內(nèi)，隨后輕輕混勻。
e. 為達(dá)到最高的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)3-5小時(shí)后宜更換為新鮮的wan全培養(yǎng)液(對(duì)于Sf9細(xì)胞，推薦在轉(zhuǎn)染4小時(shí)后更換培養(yǎng)液)。
f. 繼續(xù)在27-28℃培養(yǎng)約96小時(shí)后，收集每孔的培養(yǎng)液，500g離心5分鐘，獲得的上清即為P1代桿狀病毒(病毒滴度通常為1×106~1×107 pfu/ml)。P1代病毒4℃避光保存，如果包裝病毒時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)液為無(wú)血清培養(yǎng)液宜添加胎牛血清至終濃度為2%以保護(hù)病毒被蛋白酶降解。P1代病毒近期不使用的情況，可以適當(dāng)分裝后-80℃長(zhǎng)期保存。盡量避免反復(fù)凍融病毒，反復(fù)凍融可能導(dǎo)致病毒滴度下降10-100倍。
g. 為獲得更高滴度的桿狀病毒，可以使用P1代病毒感染Sf9或Sf21細(xì)胞等來(lái)獲得P2代桿狀病毒(病毒滴度通常為1×107 ~1×108pfu/ml)。具體操作請(qǐng)參照昆蟲(chóng)細(xì)胞Bac-to-Bac Baculovious expression system的相關(guān)操作規(guī)程。大致的步驟為使用P1代病毒感染2×106個(gè)貼壁約1小時(shí)的Sf9或Sf21細(xì)胞，推薦的病毒的MOI為0.05-0.1，過(guò)高的MOI會(huì)導(dǎo)致獲得的病毒質(zhì)量下降。27-28℃培養(yǎng)48小時(shí)后，同步驟f收集每孔的培養(yǎng)液，隨后500g離心5分鐘，獲得的上清即為P2代桿狀病毒。P2代病毒的保存條件同P1代。由于桿狀病毒在每一代的擴(kuò)增過(guò)程中均易出現(xiàn)缺少突變，因此推薦最多擴(kuò)增至P3代病毒。
產(chǎn)品選購(gòu)：
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
C0551-7.5ml | LipoInsect轉(zhuǎn)染試劑 | 7.5 mL |
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