產品名稱：abclonal愛博泰克SARS-CoV-2 ORF6抗體(A20324)現(xiàn)貨供應
產品貨號：A20324
產品品牌：abclonal愛博泰克
產品背景：嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2）是一種包膜、正義、單鏈RNA病毒，可引起2019年冠狀病毒病。病毒顆粒包括侵襲宿主細胞所需的RNA遺傳物質和結構蛋白。一旦進入細胞，感染RNA就被用來編碼構成病毒顆粒的結構蛋白，指導病毒組裝、轉錄、復制和宿主控制的非結構蛋白，以及功能尚未確定的輔助蛋白~ORF6編碼病毒輔助蛋白?；谄渑c其他冠狀病毒蛋白的相似性，ORF6蛋白被認為在病毒發(fā)病機制中發(fā)揮作用。
實驗方案：蛋白質印跡實驗：
1、樣品制備
（1）細胞收集
a. 貼壁培養(yǎng)細胞收集
用細胞刮刮下細胞或用胰酶消化處理后，400×g，離心5 min，棄上清；用適量冰PBS溶液將離心后細胞沉淀重懸，4℃，400×g 離心5min,棄上清，重復清洗步驟一次收集細胞沉淀。
b. 懸浮培養(yǎng)細胞收集
收集懸浮細胞，400×g離心5min，棄上清，適量冰PBS溶液將離心后細胞沉淀重懸，4℃，400×g 離心5min,棄上清，重復清洗步驟一次，收集細胞沉淀。
c. 組織樣本收集
把組織在預冷的表面上剪切成細小碎塊，然后用液氮或超低溫冰箱中冷凍組織30min以上，迅速加液氮研磨，研磨過程盡量控制在1~2min之內，以減少蛋白的降解。
（2）總蛋白提取
a. 細胞/組織裂解：
根據(jù)收集的細胞數(shù)量、細胞種類添加適量的裂解液。
例如常規(guī)細胞沉淀可按照1mL裂解液/107個細胞的比例加入相應體積的裂解液，加入裂解液后將沉淀吹打混勻。使用細胞破碎儀超聲樣本，每次超聲時間4-5s,間隔時間在5s左右，肉眼觀察，樣本為均一，不粘稠液體即可?；虿捎谜鹗幜呀夥绞竭M行，每隔5min將離心管置于渦旋振蕩儀上震蕩10s，裂解20min。
組織碎片可按照0.5mL 裂解液/100mg組織向勻漿器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重復5次，使組織盡量碾碎（裂解液中根據(jù)需要添加或不添加蛋白酶抑制劑）。所有理解過程，務必在低溫條件下進行。
b. 離心：
把裂解好的樣品配平后，將裂解好的樣本置于預冷的高速冷凍離心機中，13000×g離心10min，收集上清
c. 蛋白變性：
吸取少量蛋白提取液做蛋白濃度測定。向剩余的蛋白提取液的離心管中加入對應體積的5× Loading Buffer（最終工作液為1×)，待干式恒溫器溫度升至95℃后，將1.5mL離心管插入加熱孔中，95℃加熱變性10min，待液體冷卻后置于-20℃保存。
（3）蛋白濃度測定（BCA法）
a. BCA工作液的配置
根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加入1體積BCA試劑B（50:1）配置適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24h內穩(wěn)定。
b. BSA標準品梯度稀釋
取10μl蛋白標準品（5 mg/mL BSA）稀釋至50μl，使終濃度為1mg/ml。稀釋后的蛋白標準品可以-20℃長期保存。此標準品溶液的稀釋液可使用去離子水或1×PBS。將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀釋液補足到20μl。
c. 樣本濃度測定
加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，如果樣本不足20μl，需加稀釋液補足到20μl。每孔加入 200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶標儀測定樣本和標準品在562nm下的吸光度，或在540-595nm之間波長下的吸光度。根據(jù)BSA蛋白濃度標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。
2、凝膠電泳
（1）制膠器安裝
根據(jù)使用說明書安裝。
（2）凝膠配置
根據(jù)目標蛋白大小，選擇不同合適濃度的分離膠（見附表）。注意該過程注意不能有氣泡產生。
（3）上樣
待膠凝固好后，用移液器吸取樣品垂直梳孔上樣，建議總蛋白上樣量25ug/孔。注意內槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注滿，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer沒過底部3~5cm即可。
（4）電泳
上樣完成后，連通電泳儀電源，注意正負極需連接正確，設定適宜的電泳參數(shù)。建議濃縮膠電泳參數(shù)為恒壓80V，分離膠采用恒壓120V。當溴酚藍電泳到凝膠底部時，停止電泳，關閉電泳儀電源。
3、轉膜
（1）準備工作
a. 轉膜緩沖液可提前2h （即開始電泳后）放入-20℃冰箱預冷。
b. 根據(jù)膠的面積大小，將濾紙以及NC膜剪裁至合適尺寸。
c. 建議目的蛋白大于20KD可選擇0.45μm NC膜；目的蛋白小于20KD可選擇0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜。選擇完畢后將膜放在Western Transfer Buffer中浸泡備用。注意使用PVDF膜需先放入甲醇中浸泡1min左右至均勻浸透，沒有白點即可放入Western Transfer Buffer中浸泡備用。
（2）轉膜
根據(jù)目的蛋白大小，選擇合適的轉膜條件（見附表）。
4、封閉
轉膜完成后，將膜取出，放入合適的抗體孵育槽中，加入Western Blocking Buffer 室溫孵育1h，加入TBST Buffer洗滌3次，每次5 min。
5、抗體孵育
根據(jù)所使用的一抗種類，選擇進行下述其中1項的具體步驟
（1）對于無偶聯(lián)的一抗
a. 將一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗體說明書推薦比例進行稀釋,室溫孵育1.5h或4℃過夜孵育。
b. TBST Buffer洗滌4次，每次5 min。
c. 按一抗來源選取合適的HRP偶聯(lián)二抗，按照合適比例進行稀釋，室溫孵育1h。
d. TBST Buffer洗滌4次，每次5 min。
e. 繼續(xù)進行后續(xù)曝光操作。
（2）對于偶聯(lián)有HRP的一抗
a. 將一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗體說明書推薦比例進行稀釋,室溫孵育1.5h或4℃過夜孵育。
b. 用TBST Buffer洗滌4次，每次5 min。
c. 繼續(xù)進行后續(xù)曝光操作。
6、曝光
a. 吸取等體積ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混勻，配制成發(fā)光檢測工作液。推薦用量為每10cm2的膜使用1-2 mL發(fā)光檢測工作液即可。
b. 用鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體。用移液槍吸取工作液并均勻覆蓋轉印膜，室溫孵育 1-2 minutes，此步驟可在潔凈保鮮膜上或塑料盒中完成。
c. 獲取WB結果：
1) 傳統(tǒng)壓片曝光顯影：將膜固定于片夾內。暗室內壓片1分鐘，立即顯影定影，根據(jù)結果再調整壓片時間獲取最佳信噪比圖片?；蛑苯臃謩e壓片 30 秒、1、3、5分鐘，然后一起顯影定影觀察結果。
2) 化學發(fā)光成像儀獲取電子圖片：將膜放置到成像儀內，參考儀器說明書設置合適的參數(shù)以獲取優(yōu)化圖片。同時應根據(jù)靶蛋白的生物學性質如豐度等來調節(jié)成像參數(shù)。
歡迎訂購：
貨號 | 產品名稱 | 規(guī)格 |
A20324 | SARS-CoV-2 ORF6抗體 | 50 µl |
100 µl | ||
200 µl |
天津益元利康生物科技有限公司現(xiàn)貨供應abclonal愛博泰克SARS-CoV-2 ORF6抗體(A20324)，歡迎選購！
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