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引言：

農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是植物基因工程中重要的載體工具，其感受態(tài)細(xì)胞的制備質(zhì)量直接影響外源基因的轉(zhuǎn)化效率。本文將詳細(xì)介紹農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程，結(jié)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化技巧與注意事項(xiàng)，助您提升轉(zhuǎn)化成功率，滿足科研與產(chǎn)業(yè)化需求。

一、什么是農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞？

感受態(tài)細(xì)胞指通過(guò)物理或化學(xué)處理使細(xì)菌處于易于吸收外源DNA的狀態(tài)。農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備是植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的關(guān)鍵步驟，直接影響Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率。目前主流方法為CaCl?化學(xué)法，具有成本低、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。

二、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

菌株選擇：常用EHA105、GV3101等致病性缺失型農(nóng)桿菌

培養(yǎng)基：YEB液體培養(yǎng)基（配方：5g/L牛肉膏，1g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，0.5g/L MgSO?·7H?O，pH7.0）

試劑：無(wú)菌0.1M CaCl?溶液、液氮、50%甘油

設(shè)備：超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫?fù)u床、-80℃冰箱

三、分步制備流程（含關(guān)鍵參數(shù)）

步驟1：菌種活化與擴(kuò)增

取-80℃保存的農(nóng)桿菌劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)48小時(shí)

挑取單菌落接種至5mL YEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)16-18小時(shí)

優(yōu)化提示：OD???達(dá)0.4-0.6時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)收獲細(xì)胞活性最佳

步驟2：菌體收集與預(yù)冷處理

將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的50mL離心管，冰浴10分鐘

4℃、5000g離心10分鐘，棄上清

加入10mL預(yù)冷0.1M CaCl?溶液，輕柔重懸菌體

冰浴30分鐘，再次4℃離心10分鐘

關(guān)鍵點(diǎn)：全程保持低溫（0-4℃），防止菌膜結(jié)構(gòu)受損

步驟3：感受態(tài)細(xì)胞制備

棄上清，加入2mL預(yù)冷0.1M CaCl?溶液（含15%甘油）

輕柔吹打重懸，分裝至1.5mL離心管（每管100μL）

液氮速凍1分鐘后轉(zhuǎn)入-80℃長(zhǎng)期保存

配方優(yōu)化：添加終濃度10mM MgCl?可提升DNA結(jié)合效率

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