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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100 test |
|---|---|---|---|
| 貨號 | GE-20006-100 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,制藥,綜合 |
產(chǎn)品簡介
詳細(xì)介紹
產(chǎn)品介紹
本試劑盒能夠快速、簡便、高效地對基于HIV-1構(gòu)建的慢病毒進行有效滴度測定。通過對感染慢病毒的細(xì)胞基因組DNA中整合的慢病毒插入片段拷貝數(shù)進行Q-PCR測定，計算出初始病毒的有效滴度。
產(chǎn)品特點
?本產(chǎn)品采用感染病毒后靶細(xì)胞基因組作為模板，測得數(shù)據(jù)更真實
?基于Taqman探針法開發(fā)本產(chǎn)品，結(jié)果更準(zhǔn)確
?適用于所有基于HIV-1病毒構(gòu)建的慢病毒滴度測定
產(chǎn)品成分
試劑名稱 | 內(nèi)容 | 數(shù)量 |
Solution 1 | 標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板（5x10^9 c/μl） | 100μl |
Solution 2 | Lenti-primer (10μM) | 40μl |
Solution 3 | Lenti-probe –FAM/TAMRA(2.5μM) | 80μl |
Solution 4 | Taq (probe qPCR) (2X) | 1ml |
Solution 5 | ROXI(50X) | 40μl |
Solution 6 | ROX II(50X) | 80μl |
其他所需材料
細(xì)胞基因組DNA抽提試劑（離心柱法）
超純水
Q-PCR用96孔板或8連管
定量PCR儀
1.5ml無酶離心管用于樣品制備
無酶槍尖
Real-titer慢病毒滴度測定（Q-PCR）試劑盒
操作步驟
1.取感染72h后的293T細(xì)胞，胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，得細(xì)胞數(shù)為N;
2.利用細(xì)胞基因組抽提試劑盒提取293T細(xì)胞基因組DNA，測定基因組DNA總量為G (μg)，稀釋至50ng/μl備用；
注：此步驟推薦使用分離柱式基因組抽提試劑盒3.根據(jù)下表稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及基因組DNA樣品：
標(biāo)準(zhǔn)品管 | 樣品管 | ||||||
| # | 稀釋倍數(shù) | Water | 標(biāo)準(zhǔn)品 | 拷貝數(shù)/μl | 稀釋倍數(shù) | Water | 樣品(50ng/μl) |
| 1 | 10^1 | 45μl | 5μl | 5.45x10^8 | 10 | 45μl | 5μl |
| 2 | 10^2 | 45μl | 5μl of 1# | 5.45x10^7 | 50 | 40μl | 10μl of #1 |
| 3 | 10^3 | 45μl | 5μl of 2# | 5.45x10^6 | 100 | 45 | 5μl of #1 |
| 4 | 10^4 | 45μl | 5μl of 3# | 5.45x10^5 | |||
| 5 | 10^5 | 45μl | 5μl of 4# | 5.45x10^4 | |||
| 6 | 10^6 | 45μl | 5μl of 5# | 5.45x10^3 | |||
梯度稀釋取樣前，需充分混勻；
4.根據(jù)下表配制反應(yīng)液，每組配制3個復(fù)孔：
試劑 | 用量 | 終濃度 |
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本 | 2μl | *1 |
Lenti-primer (10μM) | 0.4μl | 0.2μM |
Lenti-probe (2.5μM) | 0.8μl | 0.1μM |
Taq (probe qPCR) (2X) | 10μl | 1X |
ROX | *2 | |
Water | 補至20μl |
*1：樣本除步驟3中稀釋的3種濃度外，另需一組未稀釋樣本，即總量為100ng/孔；另需設(shè)置陰性對照孔，即不添加任何DNA模板；
*2：根據(jù)所使用儀器添加：
適用儀器 | |
ROX I (終濃度1X) | 7300 Real-Time PCR System/ StepOnePlus Real-Time PCR System |
ROX II (終濃度0.5X) | 7500 Real-Time PCR System/7500 Fast Real-Time PCR System |
無需ROX | Thermal Cycler Dice Real Time System series/ LightCycler 480 System/ CFX96 Real-Time PCR Detection System |
5.上機，按照以下程序進行Q-PCR反應(yīng)：
變性 (1 Cycle)：95℃ 30s
擴增 (40 cycles)：95℃ 5s + 60℃ 30
注：可根據(jù)具體使用儀器自行調(diào)整程序。6.計算標(biāo)準(zhǔn)曲線：計算每組標(biāo)準(zhǔn)品的平均Ct值，以平均Ct值為X，Loge(copy number)為Y，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=A*Ct+B。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2需大于0.99；
7.計算樣本平均Ct值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出copy number=n。
注：以Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，若樣本Ct值超過或低于標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值，需對樣本稀釋倍數(shù)進行相應(yīng)調(diào)整。8.計算病毒滴度：舉例
Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*Nori/V
其中：n=步驟7中計算所得拷貝數(shù)；d=所用Ct值對應(yīng)的稀釋倍數(shù)(1, 10, 50, 100)；G=基因組提取所得DNA總量(μg)；N=基因組提取所用細(xì)胞數(shù)；Nori=病毒感染時細(xì)胞數(shù)；V=病毒感染時病毒用量(ml)。
計算各個Ct值位于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的不同稀釋倍數(shù)組病毒滴度，取平均值為最終結(jié)果。
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