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  BCA蛋白定量試劑盒

貨號(hào)：B5000

保存條件： BCA試劑A和B室溫保存，蛋白標(biāo)準(zhǔn)請(qǐng)-20℃凍存。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

目前世界上常用的蛋白濃度檢測(cè)方法是：BCA 蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)和 Bradford 蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)。BCA 法與傳統(tǒng)方法相比更簡(jiǎn)單、更穩(wěn)定、更靈敏度。BCA 法測(cè)定蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成分的影響，對(duì)于 5%以內(nèi)的 SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween 80 具有很好的兼容性,但 BCA 法測(cè)定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑等的影響，在 BCA 法測(cè)定蛋白濃度前應(yīng)盡量使：EDTA 濃度≤10mM，DTT 濃度≤1mM，2-ME≤0.01%。

BCA Protein Assay Kit 在 50～1000μg/ml 濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，其最小檢出量為 25μg/ml。

本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成：

試劑(A): BCA 試劑A      100ml

試劑(B): BCA 試劑 B      3ml

試劑(C): 蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)    20mg

試劑(D): 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液   10ml

自備材料：

1、酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)

2、96 孔板或 EP 管

3、恒溫箱或水浴鍋

操作步驟(僅供參考)：

1、取 1ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液wan全加入到含有 20mg 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)中，充分溶解后配制成

20mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)-20℃保存。

2、取適量的 20mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至終濃度為 500μg/ml 或所需濃度。如取 25μ l 蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20mg/ml)，加入 975μl 稀釋液，充分混勻即配制成 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：待測(cè)蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，一般可用 0.9%NaCl 或 PBS 作為溶解 BSA 稀釋液，稀釋后的 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液也應(yīng)-20℃長(zhǎng)期保存。

3、根據(jù)樣品數(shù)量，按試劑(A):試劑(B)=50:1 的比例配制 BCA 工作液，即取 50 份 BCA 試

劑 A 和 1 份 BCA 試劑B，充分混勻，即獲得 BCA 工作液(注意：正常 BCA 工作液應(yīng)為蘋果綠或墨綠色，如變?yōu)樽仙蚱渌伾珣?yīng)棄用)。

例如:取5ml BCA 試劑 A 和0.1ml BCA 試劑 B，配制成 5.1ml BCA 工作液，BCA 工作液室溫 24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

4、將 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按 0、1、2、4、8、12、16、20μl 加到 96 孔板或 EP 管中， 加稀釋液補(bǔ)足至 20μl，其蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度依次為 0、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。

5、加 20μl 待測(cè)蛋白到 96 孔板或 EP 管中，如果樣本不足 20μl，用稀釋液補(bǔ)足至 20μl。注意：如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測(cè)蛋白的溶液不同，應(yīng)在待測(cè)蛋白中加入 20μl 稀釋液；如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測(cè)蛋白的溶液相同，無(wú)需在待測(cè)蛋白孔中加入 20μl 稀釋液，以減少不同溶液的差異。

6、向各孔或 EP 管加入 200μl 配制好的 BCA 工作液，37℃孵育 20～30min。

7、酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)測(cè)定 562nm 波長(zhǎng)處吸光度(如無(wú) 562nm，540～595nm 之間的波長(zhǎng)也可)，各孔或 EP 管吸光度減去未加 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以求得的差值為縱坐標(biāo)：以標(biāo)準(zhǔn)孔或 EP 管中蛋白濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白濃度。

注意事項(xiàng)：

1、蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)粉末溶解于蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液后，即獲得蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液(即 20mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn))，該原液中含有防腐劑，不影響后續(xù)檢測(cè)，該蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液-20℃長(zhǎng)期保存。

2、待測(cè)蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否者待測(cè)蛋白與蛋白標(biāo)準(zhǔn)中所含非蛋白成分不一致，有可能導(dǎo)致測(cè)定不準(zhǔn)確。

3、如果檢測(cè)效果不佳，可以室溫放置 2h 或 60℃放置 30min，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深，顯色反應(yīng)也會(huì)隨溫度升高而加快；如果濃度較低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間或在較高溫度下孵育。

4、測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加吸光度或顏色沒(méi)有明顯變化，可能的原因是樣品中含有嚴(yán)重干擾 BCA 法測(cè)定蛋白濃度的物質(zhì)。

5、BCA 法檢測(cè)時(shí)，待測(cè)樣本中不應(yīng)含有EGTA，否則影響檢測(cè)結(jié)果。

6、因 BCA 法測(cè)定時(shí)顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深，建議每次測(cè)定時(shí)都作標(biāo)準(zhǔn)曲線，且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度，否則每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7、如果沒(méi)酶標(biāo)儀，也可用普通分光光度計(jì)測(cè)定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色皿的最小測(cè)定體積，應(yīng)按比例適當(dāng)加大 BCA 工作液的用量使總體積不小于最小檢測(cè)體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量亦相應(yīng)按比例放大；使用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度時(shí)，可以測(cè)定的樣品數(shù)量可能會(huì)顯著減少，Lablead 建議把系列標(biāo)準(zhǔn)品用量增加至 100μl，BCA 工作液用量增加至 1ml。

8、為了加快 BCA 法測(cè)定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱，但是切勿過(guò)熱，否則易失效。