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GFP Nanoab Magnetic Beads
  • GFP Nanoab Magnetic Beads
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貨物所在地:北京北京市

更新時(shí)間:2024-10-08 21:00:07

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沒(méi)有普通抗體的輕鏈和重鏈;

高親和力:解離常數(shù)達(dá)到 pM 級(jí)別;
高載量:20μl 的 slurry 可以結(jié)合 8-10μg GFP 蛋白;

較短的孵育時(shí)間,結(jié)合 5-30 min 即可;

GFP-Nanoab-Magnetic Beads

貨號(hào):GNM-25-1000/GNM-50-2000

儲(chǔ)存條件:可在 4℃保存半年,避免離心,干燥,長(zhǎng)時(shí)間保存可凍存。


產(chǎn)品描述

偶聯(lián) anti-GFP 納米抗體的磁性納米微球用于免疫沉淀 GFP 融合蛋白。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

沒(méi)有普通抗體的輕鏈和重鏈;

高親和力:解離常數(shù)達(dá)到 pM 級(jí)別;

高載量:20μl 的 slurry 可以結(jié)合 8-10μg GFP 蛋白;

較短的孵育時(shí)間,結(jié)合 5-30 min 即可;

應(yīng)用范圍

可用于免疫沉淀(IP)/免疫共沉淀(CoIP)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)/RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)、酶活性測(cè)定、質(zhì)譜分析等;

特異性

可以結(jié)合 GFP、EGFP、YFP 和 EYFP 等。

產(chǎn)品特性

保存條件:可在 4℃保存半年,避免離心,干燥,長(zhǎng)時(shí)間保存可凍存。

存儲(chǔ)緩沖液:PBS(含有 20%乙醇)。


實(shí)驗(yàn)步驟:

收集細(xì)胞:

每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)大約使用 106-107 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(約一個(gè) 10 cm培養(yǎng)皿)表達(dá)綠色熒光蛋白融合蛋白。吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基、向培養(yǎng)皿中加入 2ml預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次,利用細(xì)胞刮或胰酶消化的方法收集貼壁細(xì)胞,細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管,500 g離心 3 分鐘并丟棄上清液。

植物組織裂解處理

取適量植物組織樣本(葉片等)放置于冷凍液氮中,之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進(jìn)行研磨,盡 可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁。加入 500-1000ul RIPA 裂解液(已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等)進(jìn)行裂解,為了提高裂解效率,加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min,裂解完成后 12000 rpm,離心 30min,吸取上清 置新的離心管中,棄去沉淀。

細(xì)胞裂解:

1.用500μl 預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細(xì)胞,在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑與 1 mM PMSF(自備)。對(duì)于核/染色質(zhì)蛋白可使用 RIPA 裂解液中加入1 mg/ml DNase, 2.5 mM MgCl2,蛋白酶抑制劑與 1 mM PMSF(自備)。

2.把離心管放置在冰上 30 分鐘,可以每 10 分鐘充分吹打一次。

3.細(xì)胞裂解產(chǎn)物在 4℃,20,000 g 條件下離心 15 分鐘,轉(zhuǎn)移裂解產(chǎn)物到一個(gè)新的預(yù)冷管中,丟棄沉淀。注意:此時(shí)細(xì)胞裂解產(chǎn)物可以放在-80℃進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

平衡珠子:

4.振蕩混勻 GFP-Nanoab-Magnetic Beads,吸取 40μl slurry 500 μl 預(yù)冷的裂解緩沖液中,在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),丟棄上清液。(此步驟可選)

結(jié)合蛋白

5.將細(xì)胞裂解產(chǎn)物加入到平衡的 GFP-Nanoab-Magnetic Beads 中(如果未做第 4 步,可在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中直接加入40μl slurry),在 4 ℃冷柜中的旋轉(zhuǎn)混合儀上結(jié)合 30-60 min。如果需要,保存 50 μl 的裂解產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析。

6. 在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),丟棄上清液。如果需要,保存 50 μl 上清液進(jìn)行免疫印跡分析。

清洗珠子:

7. 用 500 μl 預(yù)冷的裂解緩沖液中重懸 GFP-Nanoab-Magnetic Beads,在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),丟棄上清液并重復(fù)洗滌 2 次。(可選:在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM)。

洗脫蛋白:

方法一:

加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重懸 GFP-Nanoab-Magnetic Beads。

95℃,10 min 條件下,加熱 GFP-Nanoab-Magnetic Beads,把免疫沉淀復(fù)合物從珠子上游離出來(lái)。GFP-Nanoab-Magnetic Beads 可在磁力架上進(jìn)行分離,收集的產(chǎn)物可以進(jìn)行 SDS–PAGE 分析。

方法二:

替代步驟 8 和 9 的可選步驟:加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脫結(jié)合的蛋白,建議孵育時(shí)間 30 秒,并不斷混勻,隨后用磁力架進(jìn)行分離,轉(zhuǎn)移上清液到新管中,為了中和酸性的甘氨酸,需添加 5μl 1.0 M Tris(pH10.4)。注意:為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步。

可選方案

方案一:

如需進(jìn)行 GFP 融合酶的活性檢測(cè),無(wú)需洗脫,可以直接檢測(cè)。

方案二:

如需進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP) 實(shí)驗(yàn),主要用于含有 GFP 融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA 相互作用的實(shí)驗(yàn)。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細(xì)胞固定,染色質(zhì)斷裂,染色質(zhì)免疫沉淀,交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),DNA 的純化以及 DNA 的鑒定。其中前期細(xì)胞固定,染色質(zhì)斷裂不變;然后接著直接進(jìn)入說(shuō)明書的第 5 步,加入細(xì)胞裂解產(chǎn)物后,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到 GFP-Nanoab-Magnetic Beads上;進(jìn)入第 6 和 7 步,分離得到復(fù)合物;進(jìn)入第 10 步,得到洗脫的復(fù)合物;后期交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),DNA 的純化及 DNA 的鑒定等同于普通的 ChIP 實(shí)驗(yàn)。RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)步驟同上。

方案三:

GFP-Nanoab-Magnetic Beads 不僅可以用于在體內(nèi)外檢測(cè)和驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用,也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法,得到洗脫的復(fù)合物后,然后進(jìn)行 SDS–PAGE 分析,用考馬斯亮藍(lán)或者銀染的方法染色后,切下未知蛋白的條帶,用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白。


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