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D0204P-50rxns-DNA Assembly Mix Plus
  • D0204P-50rxns-DNA Assembly Mix  Plus
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貨物所在地:北京北京市

更新時(shí)間:2024-12-03 14:15:51

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DNA Assembly Mix Plus基于重組原理的無(wú)縫克隆技術(shù),作為新一代的克隆方法,不依賴繁瑣的酶切、連接步驟,也不需要末端補(bǔ)平等操作,依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組,可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn),載體自連背景極低,是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。

產(chǎn)品貨號(hào)D0204P

儲(chǔ)存條件-20℃

產(chǎn)品組分

組分/規(guī)格

10T

25T

50T

DNA Assembly Mix PLUS

50μl

125μl

250μl

pUC19 Control Plasmid, Linearized

(Ampr, 40 ng/μl)

5μl

5μl

5μl

500 bp Control Fragment (20 ng/μl)

5μl

5μl

5μl




產(chǎn)品簡(jiǎn)介

基于重組原理的無(wú)縫克隆技術(shù),作為新一代的克隆方法,不依賴繁瑣的酶切、連接步驟,也不需要末端補(bǔ)平等操作,依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組,可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn),載體自連背景極低,是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。

DNA Assembly MixPLUS無(wú)縫克隆試劑盒最快僅需5分鐘即可完成單片段重組,且陽(yáng)性率高于95%。Mix中添加的輔助因子,有效提高克隆陽(yáng)性率;經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系,能夠一定程度上耐受未純化PCR產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。升級(jí)版的無(wú)縫克隆試劑盒具有更高的陽(yáng)性率、更好的兼容性。


使用簡(jiǎn)單 —— 兼容PCR與酶切體系,省去繁瑣的純化步驟

超高效率 —— 可以穩(wěn)定支持5-6片段在同一克隆體系

穩(wěn)定可靠 —— 37℃放置一周或凍融30次,無(wú)明顯下降



實(shí)驗(yàn)步驟

1、實(shí)驗(yàn)流程概要

2、線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點(diǎn),對(duì)載體進(jìn)行線性化,載體的線性化可以通過(guò)酶切或反向 PCR 擴(kuò)增完成。

① 酶切制備

推薦使用LabFD™快速內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,使載體線性化wan 全,以降低轉(zhuǎn)化背景(假陽(yáng)性克隆);若使用單酶切進(jìn)行線性化,可以適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。

1:經(jīng)雙酶切進(jìn)行線性化的載體無(wú)需去磷酸化,經(jīng)單酶切則需要去磷酸化;

2:酶切完成后,應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后再用于重組反應(yīng)。

② 反向 PCR 擴(kuò)增制備

為減少擴(kuò)增突變的引入,推薦使用高保真PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板,以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對(duì)克隆陽(yáng)性率的影響。


3、插入片段PCR引物設(shè)計(jì)

PCR引物的5' 端必須包含與其相鄰片段(插入片段或載體)末端同源的15~25 nt(推薦18nt)序列。假如載體為粘性末端,且3'端突出,則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分;若5'端突出,則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分,也可以不包含。

插入片段正向擴(kuò)增引物:

5'—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)(可選)+ 基因特異性正向擴(kuò)增序列— 3'

插入片段反向擴(kuò)增引物:

3'—基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)(可選)+下游載體末端同源序列—5'

1盡量選擇無(wú)重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆,當(dāng)載體克隆位點(diǎn)上下游25 nt區(qū)域內(nèi)GC含量為40%~60%時(shí),重組效率zui高;

2:本試劑盒所提供的 pUC 19 載體(Ampr)連接端序列如下:

4、插入片段的 PCR 擴(kuò)增

推薦使用高保真PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增,以減少擴(kuò)增突變的引入。建議使用純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)縫克隆反應(yīng),若PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,可直接使用,但加樣體積不應(yīng)超過(guò)總反應(yīng)體積的20%。


5、重組反應(yīng)

于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系:

組分

反應(yīng)體系

陰性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照(如有必要)

DNA Assembly Mix

5μl

5μl

5μl

線性化載體(ng)

50~200ng

50~100ng

pUC19 Control Plasmid,Linearized, 1 μl

插入片段

10~200 ng

-

500 bp Control,

Fragment, 1 μl

ddH2O

To 10 μl


a.最適載體用量(ng)=0.02×載體堿基對(duì)數(shù),即0.03pmol。

b.插入單片段,最適片段用量(ng)= 0.04×片段堿基對(duì)數(shù);

插入多片段,每片段zui適用量(ng)= 0.02×片段堿基對(duì)數(shù)。

1:若插入單片段的長(zhǎng)度大于載體,則應(yīng)互換載體與插入片段用量;

2:若插入片段的長(zhǎng)度小于200 bp,則插入片段應(yīng)使用5倍載體用量;

3:若按上述公式計(jì)算得到的用量超過(guò)zui低/zui高值,則建議直接按zui低/最高用量使用;

4:載體片段過(guò)長(zhǎng)、插入片段過(guò)長(zhǎng)克隆陽(yáng)性率均會(huì)降低。

重組反應(yīng)體系配制完成后,用移液槍輕輕吸打混勻各組分,避免產(chǎn)生氣泡,切勿渦旋。

② 將反應(yīng)體系置于50℃,反應(yīng)5~60min。

1:推薦使用 PCR 儀等溫控比較精準(zhǔn)的儀器進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間不足或太長(zhǎng)克隆效率均會(huì)降低;

2:插入1-2個(gè)片段時(shí),推薦反應(yīng)時(shí)間5-15min,插入3-5個(gè)片段時(shí),推薦反應(yīng)時(shí)間15-30min;

3:當(dāng)載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在4 kb以上時(shí),建議延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到30-60min

4:50℃反應(yīng)完成后,建議進(jìn)行瞬時(shí)離心,將反應(yīng)液收集至管底。

③ 將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻,之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲(chǔ)存于-20℃。

1:-20℃儲(chǔ)存的重組產(chǎn)物,建議在1周內(nèi)使用。


6、重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

5~10μl反應(yīng)液,加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中緩慢吸打混勻,冰上放置30min。42℃熱激45~60sec,冰浴5 min。加500 μl SOC或LB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)40~60min(200 rpm)。將菌液均勻涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素的平板上,倒置于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1:不同感受態(tài)細(xì)胞最后的克隆陽(yáng)性率會(huì)有所差別,推薦使用轉(zhuǎn)化效率>108 CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞;

2:菌落數(shù)取決于PCR產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度;

3:陽(yáng)性對(duì)照平板通常生長(zhǎng)大量白色單菌落,陰性對(duì)照平板只生長(zhǎng)很少的菌落。


7、陽(yáng)性克隆檢測(cè)

挑取單菌落至10 μl ddH2O中混勻,95℃裂解10 min 后,取1 μl裂解液作為模板,進(jìn)行菌落PCR鑒定,或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1:菌落 PCR 時(shí)建議至少使用一條通用引物,避免假陽(yáng)性結(jié)果;

2:必要時(shí)可進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行測(cè)序鑒定。






常見(jiàn)問(wèn)題

問(wèn)題描述

原因

解決方法

轉(zhuǎn)化效率低

感受態(tài)效率低下

使用新制備或妥善保存的感受態(tài)細(xì)胞。

DNA片段比例不佳

按照說(shuō)明書(shū)推薦的zui適用量和比例配制反應(yīng)體系。載體和插入片段的濃度測(cè)定: 若線性化載體與插入片段已經(jīng)過(guò)純化,且經(jīng)電泳檢測(cè)條帶單一或無(wú)Smear殘留時(shí),可使用超微量核酸蛋白檢測(cè)儀等基于分光光度法的儀器進(jìn)行濃度測(cè)定,但只有當(dāng)A260/A280 在1.8~2.0之間時(shí)濃度值可信;若線性化載體與插入片段未經(jīng)過(guò)純化,也可使用瓊脂糖電泳測(cè)定樣品濃度。

DNA片段純度不夠

對(duì)載體和插入片段進(jìn)行膠回收純化。由于EDTA等金屬離子螯合劑會(huì)抑制無(wú)縫克隆反應(yīng),因此純化產(chǎn)物應(yīng)溶解于ddH2O中,切勿使用Tris-EDTA等緩沖液。

反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)量

在轉(zhuǎn)化體系中,無(wú)縫克隆反應(yīng)產(chǎn)物體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。

大量克隆不含插入片段

載體線性化不wan

酶切制備線性化載體時(shí),提高快速內(nèi)切酶的使用量,延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,使用膠回收純化酶切產(chǎn)物。

相同抗性質(zhì)粒污染

以質(zhì)粒為模板進(jìn)行插入片段 PCR 擴(kuò)增時(shí),使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板,使用DpnI 等甲基化敏感型內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理,或?qū)Ξa(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

平板抗性不足

確保使用正確的抗生素,并使用新鮮制備的抗生素平板。

大量克隆含有

不正確插入片段

非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

優(yōu)PCR體系,提高擴(kuò)增特異性,或膠回收純化PCR產(chǎn)物重疊序列的擴(kuò)增引物。







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