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貨號(hào)：F0202A

存儲(chǔ)條件：-20°C

產(chǎn)品組分：

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

反轉(zhuǎn)錄試劑盒獨(dú)立引物（Primer Flexible）是一款高效、便減少污染的高質(zhì)量一鏈cDNA合成預(yù)混液， 包含M-MLV GIII Reverse Transcriptase及其反應(yīng) Buffer、RNA 酶抑制劑、dNTPs等一鏈 cDNA 合成所需的多種組分，還需加入RNA 模板、引物和水即可開(kāi)始反應(yīng)，操作非常方便。針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可靈活使用不同類型的逆轉(zhuǎn)錄引物，滿足多樣化的實(shí)驗(yàn)需求，可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景選擇Oligo(dT)20VN 或Random hexamers 或 Gene Specific Primers。使用該逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液15分鐘內(nèi)最長(zhǎng)可獲得12 kb大小的cDNA。

從細(xì)胞中提取的 RNA 往往存在基因組 DNA 污染，如果逆轉(zhuǎn)錄前不將其去除，下游 qPCR 反應(yīng)時(shí)基因組 DNA 與 cDNA 會(huì)同時(shí)被擴(kuò)增（尤其當(dāng)引物設(shè)計(jì)在同一外顯子上時(shí)），從而影響基因表達(dá)定量準(zhǔn)確性。本試劑盒采用 dsDNase 高效去除基因組 DNA 污染，dsDNase 能夠特異性消化雙鏈 DNA（dsDNA 或 DNA-RNA 雜合鏈中的 DNA 鏈），并且具有熱敏感性，在逆轉(zhuǎn)錄溫度下即可快速不可逆地失活。與傳統(tǒng)使用 DNase I 去除基因組 DNA 污染的方法相比，dsDNase 無(wú)需額外加入 EDTA 進(jìn)行失活，不僅節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，而且降低了對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的抑制。

使用方法

一、 Total RNA

針對(duì)基因組含量低的RNA 樣品(推薦方案)

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

a. 推薦采用試劑盒提取的 RNA 作為模板。

② 輕柔吸打混勻， 瞬離；

③ 37℃ 溫育2min， 以去除基因組DNA 污染；

④ 55℃ 溫育15 min;

⑤ 反應(yīng)結(jié)束后， 85℃ 溫育5 min 以終止反應(yīng)；

⑥ 迅速將獲得的cDNA 置于冰上， 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);或立即保存于-20° C。

針對(duì)基因組含量高的RNA 樣品

1.基因組DNA污染去除

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

a. 推薦采用試劑盒提取的 RNA 作為模板。

② 輕柔吸打混勻，瞬離；

③ 37℃溫育 2 min，以去除基因組 DNA 污染；

注：若 RNA 中基因組 DNA 污染嚴(yán)重，可適當(dāng)延長(zhǎng) 37℃溫育時(shí)間至 5 min。

④ 65℃溫育 2 min，使 dsDNase 失活，冰上放置。

2.第一鏈 cDNA 合成

①于冰上配制如下反應(yīng)體系：

② 輕柔吸打混勻，瞬離；

③ 55℃溫育 15 min；

注：若目標(biāo) RNA 不含 Poly(A) 結(jié)構(gòu)，可預(yù)先25℃溫育 10 min。

④ 反應(yīng)結(jié)束后，85℃溫育 5 min 以終止反應(yīng)；

將獲得的cDNA 溶液置于冰上，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；或立即保存于 -20℃。

注：1.后續(xù)實(shí)驗(yàn)為克隆實(shí)驗(yàn)，若RNA來(lái)源于真核生物，只需使用 Oligo (dT) VN 即可，加入 Random hexamers 會(huì)降低全長(zhǎng) cDNA 的產(chǎn)量；若 RNA 來(lái)源于原核生物，只需使用 Random hexamers 或 Gene Speci?c Primers。

2.后續(xù)實(shí)驗(yàn)為qPCR，請(qǐng)同時(shí)加入Oligo(dT) VN和Random hexamers以獲得mRNA不同位置逆轉(zhuǎn)錄效率均一的cDNA。

二、miRNA

1.基因組去除

①于冰上配制如下反應(yīng)體系：

② 輕柔吸打混勻，瞬離；

③ 37℃溫育 2 min，以去除基因組 DNA 污染；

注：若 RNA 中基因組 DNA 污染嚴(yán)重，可適當(dāng)延長(zhǎng) 37℃溫育時(shí)間至 5 min。

④65℃溫育 2 min，使 dsDNase 失活，冰上放置。

2.第一鏈 cDNA 合成

①于冰上配制如下反應(yīng)體系：

b. 莖環(huán)引物推薦終濃度0.25 μM，可在0.1~0.5 μM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。

② 輕柔吸打混勻，瞬離；

③ 55℃溫育 15 min；

④ 反應(yīng)結(jié)束后，85℃溫育 5 min，以終止反應(yīng)；

⑤  將獲得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；或立即保存于 -20℃。

miRNA 莖環(huán)引物及 qPCR 引物設(shè)計(jì)

1. Stem-loop RT 引物設(shè)計(jì)：

基于通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，只需要按照不同的 miRNA 序列修改最末端 6個(gè)堿基即可。通用莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC；

2.以 miR-1-5p 為例，其序列為：CAUACUUCCUUACAUGCCCAUA，只需在通用莖環(huán)序列后加上 miRNA 3' 末端的 6 個(gè)堿基的反向互補(bǔ)序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC“TATGGG"；

3. qPCR 上游引物設(shè)計(jì)：miRNA 序列除去 3' 端 6 個(gè)堿基的剩余部分作為上游引物，如 miR-1-5p 的上游引物為 ( 注意把 U 改 為 T)：CATACTTCCTTACATG。檢查引物的 Tm 值，如果 Tm 值較低，則在 5' 端加 GC 使 Tm 值接近 60℃。因此 miR-1-5p 的上游引物可設(shè)計(jì)為：GCCGCCATACTTCCTTACATG，60.3℃；

4. 下游引物是通用的，序列為GTGCAGGGTCCGAGGT；

5. 引物設(shè)計(jì)好后，需要通過(guò)預(yù)試驗(yàn)檢測(cè)引物的特異性。一般需要做熔解曲線來(lái)檢測(cè)引物的特異性；同時(shí)最好將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)產(chǎn)物是否單一（產(chǎn)物長(zhǎng)度很短，需要 3% 以上的瓊脂糖膠）。

注意事項(xiàng)

1.所有試劑使用前請(qǐng)輕輕上下顛倒混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用；

2.所用的離心管、槍頭等耗材均需保證 RNase-free；

3.為了防止 RNase 污染，請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈；

4.操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩。