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無(wú)縫克隆試劑盒

MCE 國(guó)際站：Seamless DNA Assembly Plus Kit

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲(chǔ)條件： -20℃ 2 年避免反復(fù)凍融

簡(jiǎn)介：MCE Seamless DNA Assembly Plus Kit 無(wú)縫克隆試劑盒為新一代重組克隆試劑盒，一次反應(yīng)可完成單個(gè)至多個(gè) DNA 片段的重組。其中經(jīng)優(yōu)化的 Mix 預(yù)混了重組酶和反應(yīng)緩沖液，并添加了輔助因子，可顯著提高克隆的重組效率和對(duì)雜質(zhì)的耐受度，最快僅需 5 分鐘即可完成單片段重組，且陽(yáng)性率高達(dá) 95% 以上。

概述：與傳統(tǒng)的克隆方法不同，無(wú)縫克隆技術(shù)基于基因重組原理，在目的基因引物 5′ 端引入了一段與線性化載體末端同源的堿基序列（一般為 15-20 bp），在重組酶的作用下即可將目的基因插入線性化載體中，是一種操作簡(jiǎn)單、高效且快速的 DNA 定向克隆技術(shù)。MCE Seamless DNA Assembly Plus Kit 無(wú)縫克隆試劑盒為新一代重組克隆試劑盒，一次反應(yīng)可完成單個(gè)至多個(gè) DNA 片段的重組。其中經(jīng)優(yōu)化的 Mix 預(yù)混了重組酶和反應(yīng)緩沖液，并添加了輔助因子，可顯著提高克隆的重組效率和對(duì)雜質(zhì)的耐受度，最快僅需 5 分鐘即可完成單片段重組，且陽(yáng)性率高達(dá) 95% 以上。

描述：

無(wú)縫克隆是基于基因重組的一種簡(jiǎn)便、高效、快速的DNA克隆技術(shù)，在插入片段引物的5’端添加與線性化載體末端同源的15-20bp序列，在酶的作用下，可輕松實(shí)現(xiàn)重組。

MCE Seamless DNA Assembly Plus Kit含有優(yōu)化的重組酶、反應(yīng)緩沖液和附加輔因子混合物，可顯著提高克隆效率和對(duì)雜質(zhì)的耐受性。該產(chǎn)品可完成多個(gè)DNA片段重組，單個(gè)片段重組僅需5分鐘，陽(yáng)性率達(dá)95%以上。

操作說(shuō)明：1. 載體線性化處理選擇合適的克隆位點(diǎn)，對(duì)環(huán)形載體進(jìn)行線性化處理。以下兩種方法任選其一即可。a. 酶切處理建議使用雙酶切，可減少載體自連，降低假陽(yáng)性克隆概率。若使用單酶切，建議適當(dāng)延長(zhǎng)酶切反應(yīng)時(shí)間。酶切處理后，建議進(jìn)行電泳驗(yàn)證，并對(duì)線性化載體切膠純化。b. 反向 PCR 擴(kuò)增以預(yù)線性化質(zhì)粒為模板，推薦選擇 MCE 高保真聚合酶（2× High-Fidelity PCR Master Mix, Cat. No.: HY-K0533）進(jìn)行擴(kuò)增。2. 目的基因擴(kuò)增a. 目的基因引物設(shè)計(jì)原則無(wú)縫克隆反應(yīng)要求目的基因與相鄰片段具有 15-20 bp 的末端同源性，所以目的基因上下游引物的 5′ 端均需包含一段與已知線性化載體末端同源的堿基序列，引物總長(zhǎng)度最好不要超過(guò) 40 bp，Tm 值一般在 55-65°C，GC 含量一般在 40-60%。上游引物（Primer F）：5′—上游載體末端同源序列 + 酶切位點(diǎn)（可選擇）+ 目的基因特異性正向序列—3′下游引物（Primer R）：3′—目的基因特異性反向序列 + 酶切位點(diǎn)（可選擇）+ 下游載體末端同源序列—5′注：1) 目的基因特異性正\反向序列即常規(guī)插入片段正\反向擴(kuò)增引物序列。2) 上游\下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組）b. 目的基因 PCR 擴(kuò)增推薦選擇 MCE 高保真聚合酶（2× High-Fidelity PCR Master Mix, Cat. No.: HY-K0533）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，建議對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化后再用于后續(xù)無(wú)縫克隆反應(yīng)。3. 無(wú)縫克隆a. 在冰上配制反應(yīng)體系本反應(yīng)體系最適載體用量為 0.03 pmol。當(dāng)插入單個(gè)目的基因時(shí)，目的基因與載體的最適摩爾比為 2:1。當(dāng)插入多個(gè)目的基因時(shí)，每個(gè)目的基因與載體的最適摩爾比為 1:1。注：1) 若目的基因長(zhǎng)度大于載體長(zhǎng)度時(shí)，應(yīng)互換載體與目的基因的用量，即將目的基因當(dāng)做載體，將載體當(dāng)做目的基因再進(jìn)行計(jì)算。2) 線性化載體的使用量在 50-200 ng 之間，目的基因的使用量在 10-200 ng 之間。若按照上述公式計(jì)算得到的使用量超出這個(gè)范圍，建議直接選用/最高使用量。3) 若目的基因小于 200 bp 時(shí)，建議目的基因與載體的摩爾比為 5:1.4) 若使用未經(jīng)純化的線性化載體或目的基因時(shí)，加樣體積不應(yīng)超過(guò)總反應(yīng)體積的 20%。5) 載體或目的基因片段過(guò)長(zhǎng)均會(huì)導(dǎo)致重組效率降低。b. 用移液槍輕輕吹打混勻（切勿振蕩），短暫離心后置于 50°C 反應(yīng) 5-60 min。注：1) 推薦使用 PCR 儀等溫控較精準(zhǔn)的儀器，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均會(huì)降低克隆效率。2) 當(dāng)插入 1-2 個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng) 5-15 min；當(dāng)插入 3-5 個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng) 15-30 min。3) 若載體大于 10 kb 或目的基因大于 4 kb 時(shí)，建議延長(zhǎng)反應(yīng)至 30-60 min。c. 將反應(yīng)液短暫離心后置于冰上冷卻，用于后續(xù)轉(zhuǎn)化。注：重組產(chǎn)物可于 -20°C 暫存一周，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化即可。4. 轉(zhuǎn)化a. 在冰上解凍 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞。禁止直接用手化凍，會(huì)影響感受態(tài)細(xì)胞的活性。b. 在解凍后的感受態(tài)細(xì)胞中，加入 10 μL 重組產(chǎn)物，輕輕混勻，在冰上放置 30 min。c. 將上述反應(yīng)液于 42°C 水浴熱激 45-60 s，迅速放到冰上冷卻 5 min。d. 加入 500 μL LB 或者 SOC 液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37°C，180 rpm 培養(yǎng) 1 h。e. 將菌液離心濃縮后涂布在含相應(yīng)抗生素的固體平板上，37°C 倒置培養(yǎng)過(guò)夜。注：1) 不同感受態(tài)細(xì)胞的陽(yáng)性克隆率有所區(qū)別，推薦使用轉(zhuǎn)化效率較高的感受態(tài)細(xì)胞。2) 陽(yáng)性對(duì)照平板通常出現(xiàn)大量菌落，而陰性對(duì)照幾乎沒(méi)有菌落。5. 陽(yáng)性克隆子的篩選與鑒定過(guò)夜培養(yǎng)后，理論上重組平板會(huì)出現(xiàn)數(shù)百個(gè)單菌落，挑取單菌落進(jìn)行驗(yàn)證。以下兩種方法任選其一即可。注：為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，建議將以下兩種方法篩選出的陽(yáng)性克隆子測(cè)序。a. 酶切驗(yàn)證挑取單菌落接種至含抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗(yàn)證。b. 菌落 PCR挑取單菌落至 10 μL ddH2O，95°C 裂解 10 min。取 1 μL 裂解液作為模板，直接進(jìn)行菌落 PCR。菌落 PCR 擴(kuò)增時(shí)至少使用一條通用引物，以免造成假陽(yáng)性。

注意事項(xiàng)：1. 本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

銷(xiāo)售產(chǎn)品：Peiminine  | Marizomib  | JNK-IN-7  | LLY-283  | SM 16  | Mesitaldehyde  | SU 5402  | Sodium aescinate  | Retinyl acetate  | L-Ornithine

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