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所有的分子生物學家都會告訴你：將DNA段片克隆到載體中去是一件棘手的事情。研究人員要查看復雜的限制性酶切圖譜，費盡心力找到適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶組合，然后熬過漫長的連接和轉化過程，希望能夠生成少數(shù)正確插入的克隆。那如果能夠擺脫所有這些繁瑣的步驟，在任意位點切割質粒，然后無縫插入你的靶DNA，會怎么樣呢？

南佛羅里達大學Morsani醫(yī)學院變態(tài)反應和免疫學部助理教授王佳望（Jia-Wang Wang，音譯）博士說：“我們過去一直在構建一個大尺寸的基因敲入靶載體，zui終的步驟是將一個青色熒光蛋白( cyan fluorescent protein , CFP)插入到載體中。由于插入位點沒有*的限制酶位點，我們幾次嘗試一種連接四個片段的策略，沒有取得成功。"

這一克隆困境使得王佳望和研究小組重新思考他們的策略，zui終他們轉向了另一種基因組工程系統(tǒng)——CRISPR/Cas9。他們在近期發(fā)表在《生物技術》（BioTechniques）雜志上的新研究論文中詳細描述了這種體外“CRISPR克隆"法。

王佳望說：“我們認為，既然CRISPR/Cas9已被成功應用于編輯許多物種的基因組，應該也可以用作為一種特殊的‘限制性內(nèi)切酶’來特異地切割DNA進行體外克隆。"

王佳望的克隆方法很簡單：他利用了Cas9酶精細的特異性和體內(nèi)切割能力，將DNA段片克隆到了體外的“挑戰(zhàn)性"載體中。以往的體內(nèi)研究證實，結合單導向RNA (single-guide RNA,sgRNA), Cas9能夠以遠超限制性內(nèi)切酶的特異性定點切割DNA。王佳望意識到，如果能夠在體外實現(xiàn)這樣的特異性切割，再結合一種DNA連接方法，就可以構建出一種強大的、改造和克隆DNA段片的新工具。

為了確定他們的方法的可行性，作者們采用一個22-kb的質粒和針對T3啟動子的一條sgRNA進行了測試。他們設計了多個長度不同的sgRNA版本來評估脫靶效應及切割效率。數(shù)據(jù)顯示，Cas9與一個19-bp的sgRNA一起能夠實現(xiàn)有效切割，且沒有脫靶效應，證實了這一系統(tǒng)可用于特異的位點切割大型DNA載體實現(xiàn)克隆應用。為了進一步加快和簡化克隆過程，作者們隨后利用了2009年開發(fā)的Gibson assembly方法，將一個DNA段片無縫插入到了CRISPR/Cas9線性化的22-kb大小的質粒中。

王佳望指出，盡管這一技術非常強大，能夠有效地應用于大量的載體，那些有興趣在自己的實驗室應用這一技術的研究人員在制備過程中仍然要謹慎剪切這樣的大型載體，利用高質量的Cas9酶來獲得*的結果。

雖然，較為常規(guī)的克隆應用可能不需要這種新的“CRISPR克隆"方法，但是顯然有些時候你實驗室的工具箱中有這樣的一項技術會特別的有用。王佳望和合著者指出，當采用諸如細菌人工染色體或腺病毒載體一類的大型載體開展研究，無法進行PCR擴增，想找到*的酶切位點面對著挑戰(zhàn)之時，以CRISPR/Cas9為基礎的克隆技術將為急需的DNA克隆提供一條更快、更有效的途經(jīng)。

轉載自：生物通

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