步琦SFC系統(tǒng)
純化利多卡因與乙酰氨基酚
SFC應(yīng)用
”
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簡(jiǎn)介
藥物是一種由化學(xué)或生物來(lái)源制成的產(chǎn)品，用于人類(lèi)或動(dòng)物的醫(yī)療治療，這些藥物往往以化學(xué)合成的形式來(lái)生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成是一種通常伴隨著雜質(zhì)存在的過(guò)程，因?yàn)楫a(chǎn)率很少是 100%。這些雜質(zhì)可能會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品的療效、安全性和質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。因此，對(duì)藥物進(jìn)行純化以確保合成化合物的純度和完整性是至關(guān)重要的，藥物的純化可以通過(guò)色譜法等多種方法進(jìn)行。
最近，超臨界流體色譜（SFC）已經(jīng)作為一種替代反相液相色譜（RP-HPLC）的方法出現(xiàn)。SFC 使用超臨界二氧化碳作為流動(dòng)相的一部分，這是一種清潔且環(huán)保的溶劑，很容易從最終產(chǎn)品中去除。此外，SFC 結(jié)合了氣相色譜和液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，在提供高分辨率的同時(shí)也能以更快的速度分離樣品。
在 SFC 的方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，最大的難點(diǎn)在于沒(méi)有一種通用的固定相。因此需要在不同的固定相上進(jìn)行篩選，以確定要分離的樣品的最好選擇性。CO2 的低極性溶劑特性允許在色譜柱篩選時(shí)同時(shí)考慮非極性和強(qiáng)極性的固定相。在確定最佳固定相后，就可以進(jìn)一步放大到制備規(guī)格。
在本次應(yīng)用中，我們會(huì)例舉利多卡因和乙酰氨基酚的合成案例，利用 SFC 系統(tǒng)來(lái)高效去除合成過(guò)程中的雜質(zhì)，獲取高純度目標(biāo)化合物。在這一過(guò)程中，需要先進(jìn)行合適色譜柱的篩選，再放大至制備色譜的規(guī)格。
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設(shè)備
BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色譜系統(tǒng)
BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)
BUCHI PrepPure 硅膠，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×4.6mm
HILIC柱，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure CBD，5um,250×4.6mm
氰基柱，5um,250×10mm ，(Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×10mm
BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×10mm
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化學(xué)品與樣品
化學(xué)品：
二氧化碳 (99.9%)
甲醇 (≥99%)
甲醇溶液中2M的氨溶液
甲酸（99%）
去離子水
為了安全處理，請(qǐng)注意所有相應(yīng)的MSDS！
樣品：
乙酰氨基酚合成產(chǎn)物
利多卡因合成產(chǎn)物
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程序設(shè)定
BUCHI Sepmatix 8x SFC平行色譜系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×4.6mm
流速：3mL/min（每根色譜柱）
檢測(cè)：DAD 紫外掃描 200 nm - 600 nm
流動(dòng)相條件：
0−0.5min | 5%B |
0.5 – 8.0 min | 5 – 50 % B |
8.0 – 9.4 min | 50 % B |
9.4 – 9.5 min | 50 – 5 % B |
9.5 – 10 min | 5 % B |
篩選過(guò)程自動(dòng)運(yùn)行，流速設(shè)置為 3mL/min 每通道，使用流控單元，平衡每一根色譜柱。樣品自動(dòng)注入（V = 5 μL），并開(kāi)始平行篩選（運(yùn)行時(shí)間 =10min）。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 32℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。
BUCHI Sepiatec SFC-50超臨界制備色譜系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×10mm
流動(dòng)相條件：等度運(yùn)行條件
檢測(cè)：紫外
所有 10mm ID 色譜柱都在預(yù)設(shè)流速下平衡 3 分鐘，使用自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，并開(kāi)始運(yùn)行。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 40℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。
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結(jié)果
5.1 乙酰氨基酚
乙酰氨基酚（下稱(chēng) AA），也常被稱(chēng)為對(duì)乙酰氨基酚，是一種鎮(zhèn)痛劑、解熱劑和手性藥物。它屬于非阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛劑這一類(lèi)。在化學(xué)上，它可以通過(guò)對(duì)氨基苯酚（下稱(chēng) AP）與乙酸酐的反應(yīng)來(lái)合成，在此過(guò)程中發(fā)生 N-乙酰化（見(jiàn)圖1）。為了確定乙酰氨基酚合成產(chǎn)物的最佳純化分離固定相，首先進(jìn)行了柱篩選（見(jiàn)圖1）。
▲ 圖 1：頂部：乙酰氨基酚合成的反應(yīng)方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；運(yùn)行時(shí)間 = 10分鐘。
圖1顯示，二醇基和 2-EP 相并未表現(xiàn)出分離度，硅膠相、CBD 相、氰基相和氨基相未顯示出理想的分離度，因?yàn)樗鼈儫o(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離。HILIC 和 PEI 相具有良好的選擇性和分辨率，且分辨率始終遠(yuǎn)高于 1.5（見(jiàn)表1）。1.5 的分辨率意味著可以很好地分離 2 個(gè)峰。表1 還顯示了洗脫順序，氰基相顯示出相反的洗脫趨勢(shì)，對(duì)氨基苯酚先洗脫，然后是對(duì)乙酰氨基酚。篩選結(jié)果表明，反應(yīng)并非100，因?yàn)楫a(chǎn)物中仍含有大量對(duì)氨基苯酚。
▲ 表1：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序
選擇 PEI 相色譜柱放大至制備規(guī)格，因?yàn)樗哂凶罡叩姆直媛剩ㄒ?jiàn)圖2）。根據(jù)篩選時(shí)的色譜圖，我們可以確定 AA 和 AP 在甲醇為 35−40% 之間洗脫。圖2（頂部）顯示了在 40% 甲醇等度條件下，在 10 x 250mm 的PEI 色譜柱上對(duì) AA 進(jìn)行純化的情況，結(jié)果顯示 AA 和 AP 可以非常良好地分離。因此在相同的條件下，可以實(shí)施一個(gè)堆疊注射方法，用于自動(dòng)純化并收集 AA （見(jiàn)圖2，底部）。
▲ 圖2：?jiǎn)未巫⑸洌敳浚┖投询B注射（底部）用于AA的純化；運(yùn)行條件：流速=30 mL/min， 甲醇= 40 %，溫度 = 40 ℃，壓力BPR = 150 bar，注射 = 250 µL，UV波長(zhǎng) = 254 nm；堆疊注射條件：注射次數(shù) = 10，堆疊時(shí)間 = 1.8 min，F(xiàn)ractions = 1（基于時(shí)間的）。
5.2 利多卡因
利多卡因（下稱(chēng) L），化學(xué)名為 2-二乙基氨基 -N-(2,6-二甲基苯)乙酰胺，是一種用作局部麻醉劑和抗心律失常藥物的藥物，它作為鈉通道阻斷劑起作用。利多卡因可以通過(guò)兩步合成過(guò)程生產(chǎn)（見(jiàn)圖3）。第一步中，2,6-二甲基苯胺（下稱(chēng) X）的氨基組團(tuán)被?；?。第二步中，中間產(chǎn)物（下稱(chēng) IP）通過(guò)與二甲胺的親核取代反應(yīng)轉(zhuǎn)化為利多卡因。因此，需要進(jìn)行兩步純化過(guò)程。色譜柱篩選的結(jié)果如圖3所示，篩選過(guò)程中，在改性劑甲醇中始終添加 20 毫摩爾氨水作為堿性添加劑。
▲ 圖 3：頂部：利多卡因合成的反應(yīng)方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選IP與利多卡因結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI 和 CBD；運(yùn)行時(shí)間 = 10分鐘。
從結(jié)果來(lái)看，所有色譜柱都可用于中間體 IP 的第一步純化分離，因?yàn)槎季哂谢€分離的效果。其中氨基相具有最高的分辨率，且在甲醇比例較低時(shí)就能出峰（見(jiàn)圖3）。對(duì)于第二步利多卡因的純化，氰基和CBD相無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離，而氨基再次表現(xiàn)出最佳的分離度（見(jiàn)表2）。在洗脫順序上，第一步中間體的純化出峰順序都是先 X 再 IP，而第二步的利多卡因的純化除了硅膠相之外都是先 L 再 IP（見(jiàn)表2）。
▲ 表2：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序
最終選擇 10 x 250mm 的氨基色譜柱進(jìn)行制備純化，因?yàn)樗姆直媛士偸亲罡叩模ㄒ?jiàn)表2）。氨基柱篩選結(jié)果顯示，X 和 IP 出峰時(shí)的甲醇比例約為 10 - 19%，L 和 IP 出峰時(shí)的甲醇比例約為 11 - 19%。圖 4 a) 顯示的是甲醇比例為 16% 等度條件下的 IP 的單次純化分離圖譜，圖 4 b) 顯示的是甲醇比例為 20% 等度條件下的 L 的單次純化分離圖譜。在相同的條件下，可以進(jìn)行疊層進(jìn)樣分離，分別自動(dòng)純化 IP 和 L，并進(jìn)行餾分收集（見(jiàn)圖 4 c) 和 d)）。
▲ 圖4：中間體 IP 的單次進(jìn)樣（a）和疊加進(jìn)樣（c）；運(yùn)行條件：流速 = 20 mL/min，改性劑 = 甲醇 + 20 mM 氨水，改性劑 % = 16 %，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar，進(jìn)樣量 = 170 μL，紫外波長(zhǎng) = 254 nm；疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 15，疊加時(shí)間 = 0. 75 min, Fractions = 1 (基于時(shí)間); 利多卡因L的單次進(jìn)樣 (b) 和疊加進(jìn)樣 (d) ; 運(yùn)行條件：流速 =20 mL/min, 改性劑 = 甲醇 + 20 mM 氨水, 改性劑 % = 20 %, 溫度 = 40 °C 和壓力 BPR = 150 bar, 進(jìn)樣 = 170 μL, 紫外波長(zhǎng) = 254 nm; 疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 20, 疊加時(shí)間 = 0.65 min, Fractions = 1 (基于時(shí)間)。
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結(jié)論
在進(jìn)行有機(jī)合成后，由于副反應(yīng)或轉(zhuǎn)化率未達(dá)到 100%，通常仍會(huì)存在雜質(zhì)，這些雜質(zhì)必須去除，尤其是在藥品生產(chǎn)中。
在藥物合成研發(fā)領(lǐng)域，時(shí)間與效率至關(guān)重要。BUCHI 的 SFC 色譜解決方案為研發(fā)人員提供了強(qiáng)大的工具，通過(guò) Sepmatix 8x SFC 色譜柱篩選系統(tǒng)與 Sepiatec SFC-50 制備色譜系統(tǒng)相結(jié)合，可快速篩選出合適的色譜柱并線性放大至制備規(guī)格。SFC-50 的疊層進(jìn)樣功能，不僅能實(shí)現(xiàn)無(wú)人值守自動(dòng)分離，還可顯著提高分離效率，從而加快藥物合成研發(fā)的速度。
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參考文獻(xiàn)
Medikamente & Medizinprodukte (admin.ch) (Status 23.11.2023).
doi.org/10.1016/j.chroma.2011.09.029
doi.org/10.1016/j.chroma.2012.06.029
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PRACTICAL APPLICATION OF SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY FOR PHARMACEUTICAL RESEARCH AND DEVELOPMENT, Vol. 14, M. Hicks and P. Ferguson, 2022 Elsevier Inc.
Th. Eicher und H. J. Roth; Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).
The synthesis of Lidocaine (University of San Diego).
Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-präparativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).
Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).
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