ADAR1 編輯活性報告基因細(xì)胞系的開發(fā)

時間：2024/7/11閱讀：681

簡介

ADAR酶在RNA中針對位于特定雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的腺苷執(zhí)行A-to-I編輯。ADAR1有兩種亞型——p150和p110，它們通過使用單獨(dú)的啟動子和交替剪接產(chǎn)生的。

Fig 1. ADAR editor靶向的雙鏈mRNA環(huán)示例

ADAR1功能喪失突變導(dǎo)致dsRNA傳感器的異常激活。ADAR1在多種腫瘤中高表達(dá)，并且ADAR1基因敲除可以改善對特定免疫治療（如PD-1/PD-L1阻斷）的反應(yīng)，并繞過腫瘤免疫治療抵抗機(jī)制，這使ADAR1成為治療開發(fā)的具有前景的靶點(diǎn)。

原理

細(xì)胞系含有可作為ADAR1編輯靶標(biāo)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)位于Firefly熒光素酶基因的上游，且包含終止密碼子（UAG），并可在ADAR1介導(dǎo)的編輯下轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼幔║UG）密碼子。

結(jié) 果

ADAR1過表達(dá)的HEK293細(xì)胞顯示出高熒光素酶活性，此活性在siRNA介導(dǎo)的ADAR1表達(dá)敲低后減少。

細(xì)胞系和檢測原理

Fig 2. 三種ADAR1報告基因細(xì)胞系的原理

ADAR1報告基因結(jié)構(gòu)包含一個含有終止密碼子（UAG）的ADAR1靶點(diǎn)，該密碼子位于編碼Firefly熒光素酶的序列的上游。在沒有ADAR1的情況下，熒光素酶不會轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞無熒光素酶活性。在存在ADAR1活性的情況下，腺嘌呤被轉(zhuǎn)化為肌苷，所得的密碼子對應(yīng)氨基酸色氨酸（UUG），從而使熒光素酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)成為可能。因此，ADAR1活性與熒光素酶活性直接相關(guān)。

選擇HEK293細(xì)胞是因為它們的內(nèi)源性ADAR1表達(dá)相對較低。

ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line（ #82238）需要轉(zhuǎn)導(dǎo)并穩(wěn)定整合報告基因結(jié)構(gòu)。該細(xì)胞需要經(jīng)過轉(zhuǎn)染才能表達(dá)ADAR1，并誘導(dǎo)熒光素酶的表達(dá)。
ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line（ #82239）是通過將ADAR1轉(zhuǎn)導(dǎo)到#82238，然后進(jìn)行抗生素篩選和克隆而生成的。
ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line（ #82240）是從#82239改造而成，可穩(wěn)定表達(dá)Renilla熒光素酶。Renilla熒光素酶活性作為細(xì)胞活力的指標(biāo)，讓用戶在評估化合物對ADAR1活性影響的同時評估其毒性。

報告基因優(yōu)化

Fig 3. ADAR Reporter #2具有最佳的ADAR1響應(yīng)和選擇性。

使用三種報告基因設(shè)計，生成了HEK293 cell pool，并使用轉(zhuǎn)染ADAR1質(zhì)粒的瞬轉(zhuǎn)來篩選敏感性高，響應(yīng)強(qiáng)的細(xì)胞系。

鑒于ADAR1和ADAR2的RNA靶標(biāo)序列存在重疊，ADAR2過表達(dá)可能產(chǎn)生的影響。圖3A顯示，三種ADAR報告基因中的兩種在ADAR1過表達(dá)時觸發(fā)了熒光素酶活性。其中，ADAR Reporter #2在ADAR2表達(dá)時沒有響應(yīng)，與ADAR Reporter #1相比，ADAR Reporter #2對ADAR1具有更好的特異性（圖3B）。因此，選擇ADAR Reporter #2制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

ADAR1響應(yīng)型報告基因細(xì)胞系

Fig 4. 穩(wěn)轉(zhuǎn)ADAR1響應(yīng)型報告細(xì)胞系對ADAR1有響應(yīng)，對ADAR2無響應(yīng)。

從表達(dá)Reporter #2的HEK293 cell pool中選擇穩(wěn)定的、單克隆細(xì)胞系。通過瞬轉(zhuǎn)ADAR2或ADAR1的p150或p110亞型，比較熒光素酶活性。

結(jié)果表明，與p110相比，對ADAR1 p150活性的偏好響應(yīng)，ADAR2過表達(dá)時檢測到的熒光素酶活性很小。

在21代的穩(wěn)定性測試中，該細(xì)胞系一直維持的熒光素酶活性。

ADAR1活性熒光素酶報告細(xì)胞系

為了，通過將ADAR1 p150亞型通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到ADAR1響應(yīng)型報告HEK293細(xì)胞系中，生成ADAR1過表達(dá)HEK293細(xì)胞系，可評估ADAR1為靶點(diǎn)的化合物。

ADAR1的siRNA knockdown使熒光素酶活性減少，說明熒光素酶活性來自ADAR1過表達(dá)（圖5B）。ADAR1 knockdown并不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性（圖5C）。因此，細(xì)胞死亡并未導(dǎo)致觀察到的熒光素酶活性降低。

將96孔板和384孔板進(jìn)行比較顯示，與對照組相比，細(xì)胞系具有強(qiáng)且穩(wěn)定的信號（圖6）。

Fig 5. ADAR1活性熒光素報告HEK293細(xì)胞系中的熒光素酶活性源于ADAR1的表達(dá)。

Fig 6. ADAR1過表達(dá)的報告基因細(xì)胞中ADAR1依賴的熒光素酶活性一致性高。

ADAR1活性雙熒光素酶報告細(xì)胞系

該細(xì)胞系可同時評估ADAR1活性和化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。ADAR1活性報告熒光素HEK293細(xì)胞系可穩(wěn)定、持續(xù)表達(dá)Renilla熒光素酶。Firefly和Renilla熒光素酶活性都與細(xì)胞密度相關(guān)（圖7）。

圖7. 在ADAR1活性雙熒光素酶報告基因細(xì)胞系中，F(xiàn)irefly熒光素酶和Renilla熒光素酶信號與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。

結(jié)論

三種細(xì)胞系可支持ADAR1研究的不同方面：

ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line（ #82238）可比較ADAR1修飾和突變對ADAR1活性的影響，例如研究結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系，或者研究RNA編輯的ADAR1變體。
ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line（ #82239）穩(wěn)定表達(dá)ADAR1，適用于評估ADAR1調(diào)節(jié)劑（如小分子抑制劑）的療效?？蛇M(jìn)行高通量篩選。
ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line（ #82240）可在評估靶向ADAR1化合物（如小分子抑制劑）的效力的同時，進(jìn)行毒性測定。

ADAR1相關(guān)產(chǎn)品

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