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中級(jí)會(huì)員 | 第2年

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生化試劑
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儀器耗材

吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)試劑盒

時(shí)間:2025/1/8閱讀:455
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吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)試劑盒說明書

分光光度法 50 /24

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義:

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。

吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS,Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase)是以谷氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶,對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。

測(cè)定原理:

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成 P5C 過程中分解ATP 生成ADP 和無機(jī)磷,通過鉬酸銨比色法測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生無機(jī)磷的量可確定P5CS 活性。

組成:

 

產(chǎn)品名稱

BH6017-50T/24S

Storage

試劑一:液體

60ml

4℃

試劑二:液體

6ml

4℃

試劑三:液體

6ml

4℃

試劑四:粉劑

1

4℃

試劑五:粉劑

1

4℃

試劑六:液體

25ml

RT

試劑七:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液

10ml

4℃

說明書

1  

 

試劑四用時(shí)加入 25 ml 蒸餾水,溶解后 4℃保存一周;試劑五用時(shí)加入 25 ml 蒸餾水,溶解后 4℃保存一周;

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:

將試劑七 20 倍稀釋,即取 0.1ml 試劑七加 1.9ml 蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制:

H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意:配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

自備儀器和用品:

可見外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣品酶液的制備:

1、組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(ml)15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入

1ml 試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

操作步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 660nm

2、酶促反應(yīng)(EP 管中加入下列試劑


對(duì)照管

測(cè)定管

試劑二μl


100

樣本μl


100

混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴 10min

 

試劑三μl

100

100

試劑二μl

100


樣本μl

100


混勻,8000g,25℃離心 10min,取上清液

3、定磷(EP 管或 96 孔板中加入下列試劑


空白管

標(biāo)準(zhǔn)管

對(duì)照管

測(cè)定管

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液μl


100



上清液μl



100

100

蒸餾水μl

100




定磷試劑μl

1000

1000

1000

1000

混勻,室溫放置 30min,在 660nm 處,記錄各管吸光值。

 

注意:

1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照,本試劑盒 50 管保證測(cè) 24 P5CS 活性。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無磷。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

計(jì)算

1、血清(漿)P5CS 活力的計(jì)算:

單位定義:每小時(shí)每毫升血清(漿)P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

P5CS 活力(μmol/h/ml=C 標(biāo)準(zhǔn)管×A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V ÷V ÷T=9

×A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管

2、組織中P5CS 活力的計(jì)算:

(1) 按蛋白濃度計(jì)算:

單位定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白中 P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

P5CS 活力(μmol/h /mg prot)=C 標(biāo)準(zhǔn)管×A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V ÷Cpr×V樣)÷T =9 ×A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算:

單位定義:每小時(shí)每克組織中 P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

P5CS 活力(μmol/h /g 鮮重)=C 標(biāo)準(zhǔn)管×A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V ÷(W× V

÷V 樣總)÷T=9 ×A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管÷W

 

C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/ml;V 總:酶促反應(yīng)總體積,0.3ml;V 樣:加入樣本體積,0.1ml ; V 樣總:加入提取液體積,1ml;T:反應(yīng)時(shí)間,1/6 小時(shí);Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本鮮重, g。


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